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195
IBERUS, 14 (2): 197-210, 1996
Acumulación de mercurio (Hg) y alteraciones ce-
lulares en la glándula digestiva de ostras (Ostrea
edulis) contaminadas experimentalmente
Mercury (Hg) accumulation and cellular alterations in
the digestive gland ofexperimentally contaminated oys-
ters (Ostrea edulis)
Montserrat POQUET, Montserrat BIGAS y Mercé DURFORT*
RESUMEN
En el presente estudio se han determinado los distintos niveles de concentración de
mercurio en las branquias y la masa visceral de la ostra plana y los cambios inducidos
porel Hg en el epitelio de la glándula digestiva.
Ejemplares de Ostrea edulis procedentes de cultivos del delta del Ebro (Tarragona) se
han mantenido durante un período de 22 días expuestos a concentraciones de 2,5, 5 y
10 |jg Hg/I. Los resultados de los análisis realizados mediante espectrometría de absor-
ción atómica muestran una incorporación del contaminante en lostejidos de la ostra que
se incrementa en función del tiempo. El estudio estructural y ultraestructural de la glán-
dula digestiva indica un incremento del contenido lisosómico de las células epiteliales y
unadisminución de las reservas de glucógenoy lípidos en el tejido intersticial de la glán-
dula. La capacidad de retención del contaminante en los tejidos de la ostra y las altera-
ciones intracelulares detectadas indican que las dosis de contaminante utilizadas no
deberían afectara laviabilidad de las ostras estudiadas.
ABSTRACT
The present study attempt is to determine the levéis of concentration of mercury in diffe-
rent organs ofthe fíat oyster and to describe possible changes induced in the epithelium
ofthe digestive gland.
Specimens of Ostrea edulis were collected from cultivations in the Ebro Delta (Tarra-
gona) and exposed to concentrations of 2.5, 5 and 10 |jg Hg/I for 22 days. Results of
atomic absorption spectrometry indícate that contaminants steadily incorpórate in the
oyster tissues. The structural and ultrastructural study of the digestive gland shows an
increase in lysosomal contents in epithelial cells and adecrease in glycogen and lipids in
the interstitial connective tissue of the gland. The ability to sequestrate contaminants in
oystertissues and the subcellularalterations detected indícatethatthe doses ofcontami-
nant used might notaffectthe viabilityofthe studied fíatoysters.
PALABRASCLAVE: Ostreaedulis,Hg,glánduladigestiva,glucógeno.
KEYWORDS: Ostreaedulis, Hg,digestivegland,glycogen.
* Unitat de Biología Cel.lular. Departament de Bioquímica i Fisiología. Universitat de Barcelona. Av.
Diagonal,645.08071,Barcelona.
197
IBERUS, 14 (2), 1996
INTRODUCCIÓN
zaciónendistintasindustrias,yaseaenla
utilización de combustibles fósiles que
La capacidad de los moluscos bival- liberan mercurio directamente a la
vos para incorporar y concentrar en sus atmósfera, o vertidos directamente al
tejidos cantidades importantes de meta- medioacuáticoenlasplantaspapeleraso
les traza potencialmente tóxicos han en las manufacturas químicas. El Hg
motivado numerosos trabajos de inves- tambiénhasidoutilizadocomofungicida
tigación, quehanintentado dilucidar los en tratamientos de semillas, aunque este
mecanismos implicados en dichos pro- proceso ha ido disminuyendo en los
cesos de bioacumulación. En este sen- últimos años (VoN BurgyGreenwood,
tido, especiescomoMx/tilusedulis consti- 1991).
tuyen excelentes indicadores de la con- Su importancia como agente tóxico,
taminación del medio acuático (Brooks conocida ya desde la antigüedad, se
Y RuMSBY 1965; Amiard, Metayer, puso de relieve a raíz de distintos acci-
BaudyRibeyre, 1991). dentes con graves consecuencias para la
La importancia económica de los población. El más conocido es, sin duda,
moluscos, su situación dentro de la el ocurrido en Minimata (FujiKi Y
cadena trófica y las ventajas que supone Tajima, 1992) aunque, posteriormente,
disponer de buenos indicadores frente a se dieron otros casos: Iraq (Greenwood,
los costosos y a veces difíciles análisis 1985). En todos ellos, el denominador
de aguas y sedimentos (Phillips y común fue el consumo de alimentos
Segar, 1980), hacen que estos estudios previamente contaminados, principal-
sean aún en la actualidad, un tema mente peces y moluscos, aparente-
vigente y de gran importancia. Por otro mente, enbuenestado.
lado, la contaminación del medio acuá- La importancia de los efectos tóxicos
ticoesunproceso continuo debidotanto del mercurio aumenta debido a la exis-
a aportaciones habituales (vertidos tencia de distintas formas químicas,
industriales y residuos de las grandes cada una de ellas con distintos efectos,
ciudades), como a situaciones que no siendo los más conocidos los transtor-
por ser puntuales revisten menos grave- nosneuroy embriotóxicos causados por
dad, como los accidentes de buques lasformasorgánicas (metilmercuriales).
petroleros, que originan las mareas El objetivo de este estudio reside en
negras. la determinación de las concentraciones
Existe una gran diversidad de com- de HgCh, que permitan detectar una
portamiento entre las diferentes especies acumulación significativa de mercurio
frente a la captación de contaminantes e endistintos intervalos de contaminación
incluso se hallan variaciones en una y posibles alteraciones celulares en la
misma especie respecto a distintos glánduladigestivadelaostraplana.
metales.Estavariabilidadpuedeserutili-
zada para diseñar programas de control
MATERIALYMÉTODOS
delmedioambienteempleandolosorga-
nismosmásadecuadoscomoindicadores
biológicos. Dentrodelosmoluscosbival- Los ejemplares de Ostrea edulis estu-
vos, las ostras y los mejillones han sido diados, proceden del Maresme (Barce-
ampliamente utilizados como organis- lona) aunque su posterior desarrollo y
mosbioindicadores, debido a su amplia engorde ha tenido lugar a unos 120 km,
distribucióngeográfica y a su capacidad en el delta del Ebro (Tarragona). Los
debioacumulación de distintos tipos de individuos, deambossexos, dos años de
contaminantes (Goldberg, Bowen, edadyunpesosecomediode0,8±0,lg,
Farrington, Harvey, Martin, Parker, sehansometidoaunperíodo de aclima-
risebrough, robertson, schneider y tación de 8 días para contrarrestar los
Gamble, 1978; Tavares, Rocha, Porte, efectos del cambio brusco que supone
BarceloyAlbaiges, 1988). Elinterésdel pasar de un ambiente natural con una
Hgcomocontaminanteresideensuutili- nutriciónmultiespecíficaaunasituación
198
POQUETETAL.: Acumulación de Hg y alteraciones celulares en ostras contaminadas
TablaI. Condiciones experimentales de los dos bioensayos.
TableI. Experimentalconditionsofthe twobioassays.
BIOENSAYO BIOENSAYO
I
acuarioA: control acuarioA1 control
HgCM :
acuario B: 2,5 |jg acuarioA2: control
acuario C: 5 pg HgCia/J acuario B1: 5 |jg HgCl2/l
acuario D: 10 |jg HgCla/l acuario B2: 5 |jg HgCla/l
controlada. Los cinco primeros días se Conel findeno interferirconla con-
sometieron a ayuno con el fin de estabi- centración experimental del contami-
lizarsus condicionesfisiológicas. nante, no seutilizaronfiltrosy portanto
Se han llevado a cabo dos bioensa- el agua tuvo que ser renovada diaria-
yos, utilizando en cada uno de ellos 44 mente.
individuos distribuidos en cuatro gru- En ambasexperiencias, seestablecie-
pos. Las condiciones experimentales se ron cuatro tiempos para la toma de
muestranenlaTablaI. muestras: to al final del período de acli-
Las ostras seleccionadas secolocaron matación, y ti, t2, t3, alos 7, 13, y 18 días
en acuarios de vidrio en el interior de de exposición al Hg para el primer bio-
una cesta de material plástico, con un ensayoy 8, 15, y22díaspara el segundo
volumen de agua proporcional al (Tablas II y III). En cada caso setomaron
número de individuos, a razón de 1 de dos a cuatro individuos por condi-
individuo/I. ciónexperimentalyportiempo.
Se ha utilizado agua de mar natural
proporcionada por el Parque Zoológico Espectrometría: Se ha estudiado la
de Barcelona con una salinidad del or- acumulación de Hgenbranquias y en el
den de 38%o y una temperatura media resto del cuerpo (masa visceral) de
de20°C. forma independiente. Los órganos
Las ostras han sido alimentadas me- fueron aislados en el momento de la
diante un preparado comercial del alga toma de muestras y congeladoshasta su
cianofícea Spirulina {Espirulina, B12. procesamiento.
SANTIVERI). La dosis suministrada fue Las muestras de tejido fresco (aprox.
de 0,25 g/individuo/día, aunque poste- 0,6 g) fueron sometidas a una digestión
riormente se redujo debido a que el con 2,5 mi de ácido nítrico (Suprapur)
agua utilizada era rica en diatomeas, al en bombas de teflón, a 125 °C durante
nohabersidopreviamentefiltrada. doshoras.
La cuantificación se ha llevado a
Contaminación experimental: Am- cabo mediante espectrometría de absor-
bos estudios se han realizado durante ción atómica (Espectrómetro PHILIPS
los meses de mayo y junio (1992). La PV9200), en los Servicios Científico-Téc-
fase de contaminación se inició tras nicos de la Universidad de Barcelona,
finalizar el período de aclimatación (8 adoptando la técnica del vapor frío,
días). específica de elementos altamente volá-
El mercurio ha sido introducido tiles, comoelmercurio.
como sal, HgCh, disuelta en agua desti-
lada ligeramente acidificada, sin que su Microscopía óptica: Individuos con-
adiciónvariara de forma significativa el trol y contaminados (to, t4), fueron fija-
pHysalinidad del agua delos acuarios. dosin totoconformaldehidoal 10%ein-
Las concentraciones utilizadas se indi- cluidos en parafina. Los cortes de 7}ím.
canenlaTablaL fueron teñidos rutinariamente con he-
199
IBERUS, 14 (2), 1996
TablaII. Primerbioensayo. Mercurioacumuladoen|ag/gpeso seco(ppm)enbranquias (arriba)
ymasa visceral (abajo).
TableII. Firstbioassay.Accumulatedmercury in¡jg/gdryweight(ppm) ingills(up)andvisce-
ralmass (down).
Tiempo (días) control 2,5 MQ HgCl2/l 5 ng HgCl2/l 10MgHgCl2/l
Branquias
1,196 1,196 1,196 1,196
7 0,788 4,872 10,122 23,147
13 2,694 17,963 23,370 22,581
18 3,039 26,778 52,692 61,452
Masa Visceral
0,897 0,897 0,897 0,897
7 0,888 2,776 10,380 10,846
13 1,474 11,570 29,321 24,735
18 1,844 13,169 17,660 26,994
Tabla III. Segundo bioensayo. Mercurio acumulado en |ig/g peso seco (ppm) en branquias
(izquierda) ymasavisceral (derecha).
Table III. Second bioassay. Accumulatedmercury in ¡Jg/g dry weight (ppm) in gills (left) and
visceralmass(right).
Tiempo (días) control 5 MQHgCI control 5 MgHgCÍ2/l
Branquias Masa Visceral
1 1,262 1,262 0,923 0,923
8 1,189 9,160 0,740 4,807
15 1,040 16,415 0,753 9,208
22 1,228 24,208 0,927 8,186
matoxilina-eosina o bien mediante el dratación con acetona, se efectuó en re-
método de Mallory. Las observaciones sinaSpurr(Spurr, 1969).
se han llevado a cabo con un microsco- Los cortes semifinos han sido habi-
pioOLYMPUSCH2. tualmente teñidos con azul de metileno-
bórax 1%. Las secciones ultrafinas, reco-
Microscopíaelectrónica:Fragmentos gidas en rejillas de Cu fueron sometidas
debranquiasyglánduladigestiva, delos a un contrastado rutinario con acetato
mismos individuos procesados para es- de uranilo y citrato de plomo, según la
pectroscopia, fueron prefijados durante técnica de Reynolds (1963). Para evi-
dos horas a4 °C con una mezcla de glu- denciar el glucógeno, algunos cortes
taraldehido 2,5% - paraformaldehido ultrafinos se contrastaron con la técnica
2%, tamponada con cacodilato sódico. de Thiéry (1967). Las observaciones se
Después de un cuidadoso lavado con la han realizado con un microscopio elec-
misma solución tampón, fueron someti- trónico de transmisión, PHILlPS-301 de
dos a una postfijación con tetraóxido de los Servicios Científico-Técnicos de la
osmio al 1%. La inclusión, previa deshi- UniversidaddeBarcelona.
200
PoQUETETAL.\ Acumulación de Hg y alteraciones celulares en ostras contaminadas
T
5 10
Tiempo(días)
control -5MQHgCIg/l
-2,5MgHgCIg/l -lOMgHgCyi
Figura 1.Representacióngráficadelosdatosobtenidosenelprimerbioensayo. Enordenadasfi-
guralacantidaddemercurioacumuladaen|ag/gpesoseco(ppm)yenabscisas,eltiempoendías.
A:resultadospertenecientesalasbranquias;B:resultadospertenecientesalamasavisceral.
Figure 1. Graphic results ofdatafrom thefirst bioassay. Ordénales show the Hg acumulated
quantity inpg/gdryweight(ppm), abscises time indays. A: gillsdata; B: visceralmassdata.
RESULTADOS VemosquelacantidaddeHgacumulada
enlasbranquiases siempresuperiorala
No se ha observado mortalidad sig- encontradaenlamasavisceral.
nificativa a lo largo del período experi- En la Figura lA, se observa como el
mental, para ninguna de las concentra- proceso deacumulacióndelmercurioen
cionesutilizadas. las branquias sigue una tendencia expo-
nencial, en todas las condiciones experi-
Niveles de Hg: Los resultados del mentales utilizadas, excepto en t2, 10
primerbioensayo(TablaII), confirmanel jig11, debidoseguramente, almalestado
proceso de acumulación del mercurio. de alguno de los individuos analizados.
201
IBERUS, 14 (2), 1996
Se observa, además, que en ninguno de duoscontrolydeindividuossometidosa
los casos parece llegarse a un punto de contaminación (t4) no permiten detectar
saturación. alteraciones notables en los distintos ór-
Sin embargo, el comportamiento en ganos. Sin embargo, síhay pequeñas di-
la masa visceral (Fig. IB) es distinto. La ferencias, especialmente a nivel de la
cinéticainicial sigue siendoexponencial, glándula digestiva, que podrían caracte-
pero a partir del decimotercer día se ini- rizar un grado incipiente de contamina-
ciaundescensoenelritmodeincorpora- ción, teniendo en cuenta que los análisis
ción del Hg en estos tejidos, lo que nos cuantitativos realizados mediante espec-
llevó a pensar que serían los órganos in- troscopia confirman la acumulación de
ternos los que de algúnmodo marcarían cantidadesimportantesdecontaminante.
la pauta de la cantidad máxima acumu- En los individuos control se aprecia
lableporindividuo. la configuración típica de la glándula
Esta idea, junto con el hecho de que digestiva de estos bivalvos. Los túbulos
la mayor disminución se produjo con la que constituyen la mayor parte del
concentración de contaminante interme- tejido glandular se hallan rodeados por
dia, 5 mg/1, hizo que nos decidiéramos un tejido conjuntivo intersticial laxo y
por esta condición experimental para el bien estructurado. El revestimiento de
segundobioensayo. cada uno de los túbulos está formado
Los datos referentes a este segundo por un epitelio seudoestratificado de
bioensayosemuestranenlaTabla111. En células prismáticas y polarizadas con el
este caso los acuarios 1 y 2 de cada con- núcleoenlazonabasal(Figs. 3A, B).
dición experimental fueron utilizados En los individuos contaminados, se
comoréplicas. detectauna importante desorganización
EnlasFiguras2Ay2B, vemos que se del tejido conjuntivo intersticial, y se
confirmantantolaincorporación,creciente observa la presencia en el mismo de
alolargodeltiempo,comolamayoracu- célulasconunaltocontenidoresidual,que
mulación de Hg. En las branquias, sin correspondena «célulaspardas», queno
embargo,hayimportantesdiferencias,en hemoshalladoenlosindividuos control.
relación al primerbioensayo. En primer Anivel de los túbulos de la glándula
lugar,lascantidadesacumuladassonmuy se aprecia una marcada reducción de la
inferioresy, en segundo término, la acu- altura del epitelio y del diámetro de los
mulación sigue una cinética lineal (r= mismos. En la zona apical de las células
0,9998). Porotraparte, siguemantenién- digestivas se observan dilataciones con
doseladiferenciaentrebranquiasymasa voluminosas vacuolas, posiblemente de
visceral de forma que, en esta última, a carácterlisosómico (Fig. 3C).
partir del decimotercer dia se inicia un La observación de los cortes semifi-
descensoenelritmo deincorporación. nos teñidos con azul de metileno
El comportamiento diferente de los permite identificar los dos tipos celula-
dos bioensayos podría explicarse me- res que constituyen el epitelio de los
diantelavariacióndelatemperaturaque túbulos de la glándula digestiva: células
tuvo lugar durante el segundo experi- basófilas y células digestivas (Fig. 3D).
mento(Figs.2A,B).Dehecho,losdatosto En dichos cortes se ponen de manifiesto
yti delos dosbioensayos no varían. Las algunas diferencias entre los distintos
diferenciassehacenmarcadamenteimpor- individuos estudiados: en los indivi-
tantesapartirdequelatemperaturades- duos controL el tejido intersticial que
ciendehastalos11 °C,loquesuponeuna rodea a los túbulos es rico en material
variaciónde10°Censóloundía(teniendo de reserva finamente granular, así como
encuentaquelatemperaturasemedíaen en gotas lipídicas, que se ponen de
el momento de cambiarel agua lavaria- manifiesto por su metacromasia con el
ciónrealpodríahabersidomayor). azul de metileno (Fig. 3E). En los indivi-
duos contaminados se observa una dis-
Alteraciones celulares: La observa- minución drástica de dichas reservas
ciónde los cortes en parafina, de indivi- (Fig.3F).
202
POQUETETAL.: Acumulación de Hg y alteraciones celulares en ostras contaminadas
12 1{ 24
Tiempo(días)
T
6 12 1í
Tiempo(días)
m
control 5 HgCi,/l
Figura2. Representacióngráficade los datos correspondientes al segundobioensayo. Enel eje
de ordenadas izquierdo se representa lacantidad de mercurio acumulado en ppm y en el dere-
cho la temperatura en °C; en abscisas se representa el tiempo en días. A: resultados en bran-
quias; B: resultados de lamasavisceral.
Figure 2. Graphic results ofdatafrom the secondbioassay. Left ordénales show the Hg acu-
mulatedquantityinppm, rightordenatesshowtemperaturein°C;abscisestimeindays.A:gills
data; B: visceralmassdata.
Enlos individuos control, las células región apical debido al incremento del
basófilas presentan una distribución número de lisosomas. En ambos tipos
homogénea del retículo endoplasmático celulares los núcleos presentan una
(Fig. 4D) en la periferia del núcleo y heterocromatina regularmente distri-
muy escasos lisosomas y granulos de buida y un prominente nucléolo. En la
secreciónenla zona apical.Ambos tipos regiónbasal de ambos tipos celulares se
celulares presentan cilios y escasos aprecian invaginaciones de la mem- I
microvilli, si bien las células digestivas brana (Figs. 4B, D), que ocasionalmente
se diferencian por la dilatación de la puedenenglobaralgunasmitocondrias.
203
IBERUS, 14 (2), 1996
Eltejidoconjuntivointersticialsehalla algunas dilataciones en la envoltura
enestrecho contacto con la lámina basal nuclear y, en algunos casos, fragmenta-
del epitelio que reviste los túbulos (Fig. ción del material nucleolar. Únicamente
4A).Enlosindividuoscontrolseaprecian escasas células presentan estadios avan-
numerosas inclusiones lipídicas distri- zadosdenecrosis.Enloscortesultrafinos
buidas en la zona más periférica de la eltejidoconjuntivointersticialrevelauna
célula. Asimismo, se detectaunelevado disminuciónnotabledelcontenidodeglu-
contenido en glucógeno que se pone de cógeno y lípidos, lo que le confiere un
manifiesto con la técnica de Thiéry aspectolaxo característico.
(ThiÉry, 1967) (Figs. 4B, C). Las células
digestivas de los túbulos presentan un
contenidoenglucógenomásbienescaso. DISCUSIÓN
Enlosejemplaressometidosa21 días
de contaminación se observa un incre- Los resultados obtenidos ponen de
mentoenelnúmeroytamañodelosliso- manifiesto la capacidad O. edulis para
somas de las células digestivas (Fig. 4E) alcanzar niveles de 50 a 60 ppm de Hg
respectoalosindividuoscontrol(Fig.4D). (peso seco), después de un intervalo de
Anivel del núcleo se observauna distri- contaminación de 18 días, a concentra-
bución más laxa de la heterocromatina, ciones de 5 y 10 jAg de HgCk/l, sin que
(Página derecha). Figura 3. A: corte de parafina de la glándula digestiva de un individuo
control, en el que se aprecialatexturadel tejido conjuntivo intersticial (T) y la distribución en
el mismodelostúbulosdelaglándula(Gd) yvasoshemolinfáticos (v). (H/E). B: detallede los
túbulos de laglánduladigestiva, del mismo ejemplar. Se observael epitelio seudoestratificado
(ep) y las distintas configuraciones que adoptan la luz de los túbulos (L). (H/E). C: corte de
parafina de glándula digestiva de un individuo sometido a 5mg de HgCh durante 21 días. Se
aprecia una clara desestructuración del tejido conjuntivo intersticial (T) y la presencia en el
mismo de células con un alto contenido residual (célula parda: cp). Nótese la aparición en la
zona apical de las células de los túbulos, de grandes lisosomas (flecha). (H/E). D: corte semi-
fino de la glándula digestiva de un individuo control, donde se ponen de manifiesto los dos
tipos celulares que componen el epitelio, células de carácter basófilo (b) y células digestivas
(d). (Azul de metileno). E: corte semifino de glánduladigestiva de un individuo control, en el
que se observa el tejido intersticial que rodea a los túbulos, formado por células llenas de
materialgranulardereserva(*) e inclusioneslipídicas (flechas). (Azul de metileno). F: imagen
correspondiente a la anterior, pero de un individuo sometido a contaminación durante 21 días.
Se observa como las células que rodean los túbulos aparecen vacías (*). (Azul de metileno).
Escalas,A: 100|jm; B-F: 50|am.
(Rightpage). Figure 3. A: paraffin section ofthe digestive gland ofa control specimen,
showing the texture ofthe intersticial connective tissue (T) and the distribution ofthe gland
tubules (Gd) andhemolynphaticducts (v). (H/E). B: detailofthedigestiveglandtubules ofthe
same specimen. The pseudostratified epithelium (ep) and the different arrangements the
tubules span (L) can have are visible (H/E). C: paraffin section ofthe digestive gland ofan
specimen exposedto5mgHgCbfor21 days. Itisnoticeable thecleardesestructuration ofthe
intersticial connective tissue (T) and thepresence in the latter ofcells with a high residual
contení(browncell: cp). Noticetheappearance in thetubulescellsapicaláreaofgreatlysoso-
mes(arrow). (H/E). D: semithinsection ofthedigestiveglandofacontrolspecimen, wherethe
twocellulartypeswhichmakeuptheepithelium, basophile(b)anddigestive (d)cells, arenoti-
ceable. (Methylene blue). E: semithin section ofthe digestive gland ofa control specimen,
showing the intersticial tissue surrounding the tubules, made up ofcellsfull ofgranular
reserve material (*) and lipidie inclusión (arrows). (Methylene blue). F: the same as E, but
belonging to an specimen exposed to contaminationfor 21 days. N,v' that cells surrounding
thetubulesareempty(*). (Methyleneblue). Scalebars.A: 100pm; B-F: 50pm.
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