biyokimya uygulama el kitabı

132 Pages·2015·14.16 MB·Turkish

ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ
TIP FAKÜLTESİ YAYINLARI

BİYOKİMYA
UYGULAMA EL KİTABI
Ç U K U R O V A Ü N İ V E R S İ T E S İ T I P F A K Ü L T E S İ Y A Y I N L A R I
Biyokimya Uygulama El Kitabı
Prof. Dr. Abdullah TULİ
Prof. Dr. Kıymet AKSOY
Prof. Dr. Levent KAYRIN
Prof. Dr. Nurten DİKMEN
Prof. Dr. Mehmet Akif ÇÜRÜK
Doç. Dr. Tamer C. İNAL
Doç. Dr.Özlem Görüroğlu Öztürk
Öğr. Gör. Dr. Ebru Dündar Yenilmez

Biyokimya Anabilim Dalı
2015 Adana
İÇİNDEKİLER

Genel Laboratuvar Bilgileri ..................................................................................................... 1
Spektrofotometre ...................................................................................................................... 7
Asit-Baz, pH ve Titrasyon ....................................................................................................... 12
Karbohidratlar ........................................................................................................................... 29
Lipitler-Yağlar ............................................................................................................................ 39
Proteinler .................................................................................................................................... 48
Kağıt Kromatografisi ................................................................................................................ 58
Enzim.......................................................................................................................................... 64
Açlık Kan Şekeri Tayini ............................................................................................................ 72
PCR Uygulamaları ..................................................................................................................... 78
Elektroforez ............................................................................................................................... 86
Rutin İdrar Analizi .................................................................................................................... 95
Oral Glukoz Tolerans Testi ..................................................................................................... 112
Üre Analizi ................................................................................................................................. 117
Ürik Asit Tayini ......................................................................................................................... 122
EKLER....................................................................................................................................... 124

i
ÖNSÖZ
Birçok bilim dalının eğitiminde temel taşlardan birini oluşturan Biyokimya her gün ilerleyen ve
gelişmelere kapısını açık tutan uygulamalı bilim dalıdır. Biyokimya eğitimi ancak uygulama ile koşut
yürütüldüğünde bir anlam kazanmakta, kuramsal bilgilerin pekiştirilmesinde önemli bir zemin
oluşturmaktadır. Bu kitabı yazmaktaki amacımız, Tıp Fakültesi öğrencileri için bu koşutluğu biraz olsun
sağlamak, ayrıca daha sonraki baskılarda olası gelişmeler ışığında düzenlemeler yaparak bir kaynak
oluşturmanın yanında, bir açıdan da biyokimyasal yöntemlerin gelişim sürecine sinema şeridi akışıyla bir bakış
yaratmaktır.
Kitabın hazırlanışında emeği geçen öğretim üyelerine (Prof. Dr. Abdullah TULİ, Prof. Dr.
Sakine Kıymet AKSOY, Prof. Dr. Levent KAYRIN, Prof. Dr. Nurten DİKMEN, Prof. Dr.
Mehmet Akif ÇÜRÜK, Doç. Dr. Tamer Cevat İNAL, Doç. Dr. Özlem Görüroğlu ÖZTÜRK,
Öğr. Gör. Dr. Ebru Dündar YENİLMEZ) ve Araştırma Görevlilerine (Arş. Gör. Duygu
Düzgünce BOĞA, Bio. Ümit YAŞAR, Bio. Gülüzar ÖZBOLAT, Arş. Gör. Umut KÖKBAŞ,
Arş. Gör. Mustafa Muhlis ALPARSLAN, Arş. Gör. Başak SANNA, Arş. Gör. Dr. Nevin
YILMAZ, Mol. Bio. Kezban KARTLAŞMIŞ, Kim. Mehmet BULUT) teşekkür ederiz.

Ç.Ü. Tıp Fakültesi
Biyokimya Anabilim Dalı
ii
GENEL LABORATUVAR BİLGİLERİ 1

Genel Laboratuvar Bilgileri

LABORATUVAR ÇALIŞMALARININ KAPSAMI VE AMACI
Bilim; evreni ve doğayı anlama yolunda, deneysel yöntemlerle ve gözlemlerle elde ettiği bilgi
birikimlerine dayanarak yasalar çıkarmaya çalışan disiplinlerin tümü olarak tanımlanabilir. Bu
disiplinlerden biri olan Biyokimya yaşamı kimyasal temellerde tanımlamayı ve anlamayı kendisine
amaç edinmiştir. Günümüzde Biyokimya; Ekoloji, Klinik Biyoloji, Tıp, Farmakoloji ve Ziraat gibi
bir çok disiplinin temelini oluşturmaktadır.
Bilim ve teknolojideki hızlı ilerlemeler her şeyden önce kontrollü deneylere ve bu
deneylerden ortaya çıkan sonuçlara dayanmaktadır. Pozitif bilimleri temel alan disiplinlerde
öğrenim gören öğrenciler bilimsel gözlem yapmayı ve bilimsel düşünmeyi öğrenmelidirler.
Gözlemin nasıl yapılması gerektiği en iyi laboratuvarlarda öğrenilmektedir. Yapılan gözlemlerin ve
alınan verilerin doğruluğu, değerlendirilmesi ve yorumlanması da en az deneyin hassas bir şekilde
yapılması kadar önemlidir.
Klinik Biyokimya biyolojik sıvı ve dokuların analizi ile hastalıkların tanısında, tedavisinde ve
tedavinin takibinde önemli bilgiler sunan bir bilim dalıdır. Günümüzde, vücut sıvıları kullanılarak
yüze yakın parametre bu amaç için Klinik Biyokimya laboratuvarlarında analiz edilmektedir.
Bu uygulama el kitabında tıp fakültesi öğrencilerine klinik biyokimyanın analiz
yöntemlerinin prensiplerini aktarabilmek amacıyla temel deneyler seçilmiştir. Deneylerde materyal
olarak vücut sıvıları kullanılacak ve bu sıvılarda kimyasal ve enzimatik analizler; kolorimetrik,
elektroforetik ve kromatografik yöntemlerle analiz edilecektir. Bu teknikler klinik biyokimyada
halen geniş uygulama alanları bulmakta ve çoğu analizin prensibini içermektedir.

CAM MALZEMELER
Laboratuvarlarda kullanılan malzemeler genelde camdan yapılmaktadır. Cam malzemelere
ek olarak; plastik, metal, ahşap ve porselen malzemeler de laboratuvarlarda sıkça kullanım alanı
bulurlar (Şekil 5). Cam malzemelerin bir bölümü çözeltilerin ölçümü amacıyla kullanılırken diğer
bölümü çözeltilerin aktarılması, taşınması ve saklanması amacıyla kullanılır. Bu nedenle cam
malzemeleri derecelendirilmiş (Şekil 3) ve derecelendirilmemiş (Şekil 4) olarak iki ana gruba
ayırabiliriz.

Derecelendirilmiş Cam Malzemeler
Sıkça kullanılan dereceli cam malzemeler; mezür, büret, pipet ve balon joje olarak
sıralanabilir. Dereceli cam malzemeler genellikle sıvıların hacimlerinin ölçülmesinde kullanılır.
Ölçüm yapılırken işaretin göz hizasında tutulması gereklidir. Sıvıların hassas ölçümlerinde,
sıvıların yüzey gerilimi ile dar cam borularda oluşan menüsküsün doğru okunması önemlidir.
Sıvıların büyük bir çoğunluğu dar cam borularda iç bükey menüsküs oluşturur. Cıva gibi
moleküller arası birleşme kuvveti büyük olan sıvılarda ise dış bükey menüsküs oluşur. İç bükey bir
menüsküs durumunda hacim, menüsküs işaret çizgisine teğet geçecek şekilde, en düşük
noktasında okunur (Şekil 1).
2 GENEL LABORATUVAR BİLGİLERİ

Menüsküs

Şekil 1. Menüsküsün okunuşu

Mezür (dereceli silindir): Üzerlerindeki bir seri çizgilerin ölçülebilen hacimleri gösterdiği
mililitre olarak işaretlenmiş, hassasiyet gerektirmeyen sıvı ölçümlerinde kullanılırlar.
Büret: Herhangi bir hacmi maksimum kapasitelerinde boşaltmaya yarayan alt kısmında bir
musluk bulunan ölçüm malzemeleridir. Sıvıların titrasyonunda da kullanılır.
Pipet: Genellikle kaplar arasında belirli sıvı hacimlerinin ölçülerek aktarılmasında kullanılır.
Pipet orta ve başparmak arasında tutulur (Şekil 2). Çözelti istenilen hacim çizgisini biraz geçinceye
kadar hafif bir emme ile çekilir. Üst ucu işaret parmağı ile hemen kapatılır. İşaret parmağını
baskısı çözelti hacim çizgisine gelinceye kadar yavaş yavaş azaltılır. Pipetler boşaltılırken üst
ucundan ve dik konumda tutulur. İşaretleme pipetin ucunda biten pipetlerde son damla üflenerek
boşaltılır. İşaretleme pipetin ucundan yukarıda bitiyor ise işaretin altında kalan miktar boşaltılmaz.

Şekil 2. Pipetin tutuluşu

Balon joje: Tampon ve standart çözeltiler gibi derişimlerinin hassas olarak ayarlanması
gereken çözeltilerin hazırlanmasında kullanılır. Hacimleri 1-4000 mL arasında değişen modelleri
mevcuttur. Hazırlanacak çözelti için gerekli katı veya sıvı madde tartılıp balon jojeye aktarıldıktan
sonra bir miktar çözücüde tamamen çözüldükten sonra son hacme çözücü ile tamamlanır.
GENEL LABORATUVAR BİLGİLERİ 3
Derecelendirilmemiş Cam Malzemeler
Beher, erlen, balon, şişe gibi ölçeklendirilmemiş bazı cam malzemeler her ne kadar belirli
hacimleri gösterirlerse de duyarlı hacim ölçümlerinde kullanılmazlar. Bu kaplar ölçmeden çok esas
olarak sıvıyı bulundurmak için kullanılırlar.
Beher: Taban ve ağız kısmı aynı çapta olup genellikle bir sıvının başka bir kaba
aktarılmasında, çözelti hazırlanmasında, karıştırılmasında ve ısıtılmasında kullanılır.
Erlen: Dar bir boyun ve geniş bir tabanı olan konik yapıda cam kaplardır. Özellikle
buharlaşması istenmeyen çözeltilerin hazırlanmasında ısıtılmasında ve titrasyonlarında kullanılır.
Ağızları dar olduğu için çalkalanmaları kolaydır.
Balon: Hacim ölçümü yapılmaz çözeltilerin hazırlanmasında ve ısıtılmasında kullanılırlar.
Ölçeklendirilmemişlerdir.
Cam şişe: Hazırlanan çözeltilerin saklanmasında kullanılır. Çözeltinin güneş ışınlarından
korunması amacıyla çoğunlukla koyu renklidirler. Üzerinde çözelti ile ilgili etiket olmalıdır, etikette
çözeltinin adı, hazırlanış tarihi ve hazırlayanın adı yazılmalıdır.
Bu ölçü malzemelerinin dışında çeşitli amaçlarla kullanılan deney tüpü, cam çubuk (baget),
cam boru, huni, saat camı, havan, petri kutusu, desikatör vb. gibi malzemeler de laboratuvarda
sıkça kullanılmaktadır.

Mezür (dereceli silindir)

Pipet

Folin-Wu tüpü
Dereceli balon (balon joje)

Büret
Şekil 3. Derecelendirilmiş cam malzemeler
4 GENEL LABORATUVAR BİLGİLERİ

Balon çeşitleri

Beher çeşitleri Deney tüpü

Ç eşitli santrifüj tüpleri Saklama şişesi Erlen çeşitleri

Şekil 4. Derecelendirilmemiş cam malzemeler
GENEL LABORATUVAR BİLGİLERİ 5

Temizlik fırçası

Çeşitli huniler
Ayaklı spor

Üç ayak Kil üçgen Amyant tel Bunsen beki

Süzgeçli huni Ayırma hunileri

Porselen kroze Büret kıskacı

Piset
Şekil 5. Çeşitli laboratuvar malzemeleri
6 GENEL LABORATUVAR BİLGİLERİ
ÇÖZELTİLER VE DERİŞİM KAVRAMLARI
İki veya daha fazla bileşenin homojen karışımlarına çözelti denir. Bu bileşenler, çözücü
içinde iyon ve/veya moleküllerine kadar ayrılırlar.
Bir çözeltiyi oluşturan maddelerden her birine o çözeltinin bileşenleri denir. Bu
bileşenlerden bağıl miktarı fazla olana çözücü, miktarca az olana ise çözünen denir. Örneğin tuzlu
suda, suya çözücü, tuza çözünen denir.
Bileşenleri birbiri içine dağılmış fakat ayrı fazlarda bulunan çözeltilere heterojen çözeltiler
denir. Bir sıvı içinde bir katının dağılmasıyla oluşan heterojen karışımlara süspansiyon (örn.
Penisilin çözeltisi) denir. Sıvı içinde dağılan madde sıvı ise böyle çözeltilere emülsiyon (örn. Su ile
karıştırılmış sıvı yağlar) denir. Bir çözelti içinde dağılan maddenin tanecikleri tek tek atom ya da
moleküllerine dağılmış ise, böyle karışımlara homojen karışım yani çözelti denir. Böyle
çözeltilerin her bir noktası aynıdır. Örneğin glukoz distile su içerisinde tamamen çözündüğünde
şeker molekülleri tek tek sıvı faza geçerler ve homojen bir karışım oluşur.
Bir çözeltideki çözünenlerden birinin madde miktarına, o bileşenin içinde bulunduğu
çözeltideki derişimi (konsantrasyonu) denir. Çözünenin çözelti içindeki miktarı ne kadar çok
ise, derişimi de o kadar büyüktür. Yani daha derişiktir. Derişimi daha küçük ise çözelti daha
seyreltik olur ve az miktarda çözünen içerir.
Bir çözeltinin derişimi; çeşitli derişim birimleri ile tanımlanabilir. Biyokimyasal
hesaplamalarda sıklıkla kullanılan derişim birimleri aşağıda tanımlanmaktadır.
1- Yüzde (%) çözeltiler: Bir çözeltinin derişimi genellikle yüzde olarak tanımlanır.
Yüzdenin anlamı 100 mL veya 100 g çözeltideki çözünmüş olan madde miktarıdır. Yüzde
çözeltilerde birim verilmemiş ise katılar için tartılacak madde gram, sıvılar ise mililitre cinsinden
alınır. Yüzde derişimlerin tanımlanmasında kullanılan üç en temel yöntem aşağıda sıralanmıştır.

Çözünenin ağırlığı
a) Yüzde ağırlık(%w/w) = X100
Çözücünün ağırlığı

Çözünenin hacmi
b) Yüzde hacim (%v/v)= X100
Çözücünün hacmi

Çözünenin ağırlığı
c) Yüzde ağırlık-hacim(%w/v)= X100
Çözücünün hacmi

w/v yüzde derişim birimi derişimlerinin çok hassas olarak hazırlanmalarını gerektirmeyen
laboratuvar çözeltilerinin hazırlanmasında sıklıkla kullanılır.
2- Molar çözeltiler: Bir çözeltinin Molaritesi (M), o çözeltinin bir litresinde çözünmüş
maddenin mol miktarı ile tanımlanır. Litresinde mol ile ifade edilen miktarlarda madde
bulunduran çözeltilere de molar çözelti denir. Molar çözeltiler genellikle köşeli parantez ile
gösterilirler, örneğin, H+ iyonunun molaritesi=[H+]. Bir çözeltinin molaritesini hesaplamak için
çözünen maddenin ağırlık cinsinden miktarını ve moleküler ağırlığını bilmemiz gerekir.
3- Molal çözeltiler: Bir çözeltinin molalitesi (m), o çözeltinin çözücüsünün 1000
gramında çözünmüş çözünenin mol cinsinden miktarına karşılık gelir. Özellikle farklı sıcaklıklarda
yapılacak çalışmalar için molalite biriminin kullanımı doğruluğu artırıcı bir etkendir.
4- Normal çözeltiler: Litresinde ekivalan ile ifade edilen miktarlarda madde çözünmüş
bulunan çözeltilere normal çözeltiler denir. Bir çözeltinin bir litresinde çözünen maddenin
ekivalan gram sayısı o çözeltinin normalitesine eşittir. “N” harfi ile gösterilir.