Aptitude des Dermatophytes dans la production des Antibiotiques et leurs applications possibles

143 Pages·2017·2.13 MB·French

REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE

Ministère de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique

UNIVERSITE D’ORAN (ES – SENIA) Faculté
des sciences – Département de Biologie

THESE DE DOCTORAT D’ÉTAT

ES-SCIENCES

Spécialité : Microbiologie Appliquée

Présentée par:

Kheira HAMMADI

Aptitude des Dermatophytes dans la
production des Antibiotiques
et leurs applications possibles

Soutenue le 23 Décembre 2007

Devant le jury composé de:

Président : SLIMANI. M ; professeur ; Université d’Oran.
Rapporteur : SELSELET-A.G ; professeur ;Université de Mostaganem.
Examinateurs : KIHAL.M ; professeur ; Université d’Oran.
HENNI ; D -eddine ; professeur ; Université d’Oran.
BOUDEROUA.K ; MC ; Université de Mostaganem.

2006-2007
S O M M A I R E

Introduction générale……….………………………………………………………………………… 01
Chapitre I : Rappels bibliographiques. 04
1- Généralités sur les Dermatophytes
1-2- Définition……………………………………….………………………………………………………….….. 04

1-3- Historique….….…………………….…………..………………………………………………………..…... 04

1-4- Classification des Dermatophytes……………..…..………………………………...………………...… 05

1-5- Caractères biologiques………………………………………………….…...………………………..…… 07
1-5-1- Habitat.……...…………………………………………...………………………………….….... 07
1-5-2- Propriétés nutritionnelles et physico-chimiques………………………….……………….…. 07

1-6-Caractères morphologiques………………………………………………….……………...…………..… 08
1-6-1- Morphologie macroscopique…….....................................……...………………….…….... 08
1-6-2- Morphologie microscopique………………..…...…………………………………....……..… 08
a) Le mycélium végétatif…………………..…………………………..……………………..……... 08
b) Le mycélium aérien…………………..…………………………………………………....……... 08
c) Les formes de reproduction………………………………………..…………………………….. 09

1-7- Origine………...……………………………………………………………………………………….....…… 09
1-7-1- Anthropophiles……………………………………………………………………….………………. 09
1-7-2- Zoophiles…………………………………………………………………………….……………….. 10
1-7-3- Géophiles…………………………………………………………………...…………….………….. 10

1-8- Facteurs favorisants le développement des dermatophytes…………..……………………………. 10

1-9- Pathogénie…………………………………………………………………………….……………………… 10
1-9-1- Mode de végétation sur la peau……...……………………………………………………….…… 10
1-9-2- Mode de végétation dans l’ongle……………………………………………………………….….. 11

1-10- La production des antibiotiques par les dermatophytes………………………………………..….. 11
1-10-1- Les types d’antibiotiques produits par les dermatophytes………………………...……….….. 11
1-10-2- Effets relatifs à la production d’antibiotiques par les dermatophytes……………………….... 12

2- Les Antibiotiques…………………………………………………………………………………………. 14

2-1- Définition……………..…………………………………………………………………………………..…… 14

2-2- Classification………………….……………………………………………………………………………... 14

2-3- Mécanisme d’action des antibiotiques sur les germes……...………….………….………………… 16
2-3-1- Antibiotiques actifs sur la paroi bactérienne…………………………………...……………….… 16
2-3-2- Blocage de la synthèse des pré curseurs durs peptidoglucan………………………..…….….. 17
2-3-3- Blocage de l’étape de transglycosylation…………………………………………………………. 17
2-3-4- Blocage de l’étape de transpeptidation…………...………………………………………………. 17
2-3-5- Antibiotiques actifs sur la synthèse protéique……………………………...…………………….. 17
2-3-6- Antibiotiques actifs sur le métabolisme des acides nucléiques et de leurs précurseurs…….. 18
2-3-7- Antibiotiques inhibiteurs des voies métaboliques…...………………………………………….. 18
2-3-8- Antibiotiques anti-anaérobies des voies métaboliques…………………………………...…….. 18

2-4- La résistance bactérienne aux antibiotiques….…………………………………….…………………. 19
2-4-1- Mécanisme biologique de la résistance bactérienne………………………………………......... 19
3- Les Antifongiques………………………………………………………………………………………… 20

3-1- Définition…………………………………………………………………………………………………….... 20

3-2- Historique……………………………………………………………………………………………………... 20

3-3- Antifongiques produits par les actinomycètes………………………………………………………… 22
3-3-1- Cyloheximide…………..………………………………………………………………………..… 22
3-3-2- Les polyènes…………..………………………………………………………………………...….. 22
a) Amphotéricines B…………………………………………………………………………………. 22
b) Nystatine…………………………………………………………………………………………… 23
c) Piramicine………………………………………………………………………………………….. 23

3-4. Antifongiques produits par des champignons…………………………………………………………. 23
3-4-1- Griséofulvine…………………………………………………………………………………………. 23

3-5. Agents chimiques……………………………………………………………………………………………. 24
3-5-1- Pyrimidine…………………………………………………………………………..………………… 24
3-5-1-1- Fluorocytosine……………………………………………………………………………… 24
3-5-2- Les azolés………………………………………………………………………………………….… 25
3-5-2-1- Les imidazolés……...……………………………………………………………………… 25
a) Miconazole…...……………………………………………………………………………….. 25
b) Ketoconazole……………………………………………………………………………….… 26
3-5-2-2- Les triazolés……………………………………………………………………………… 26
a) Flaconazole…………………………………………………………………………………… 26
b) L’itraconazole…………………………………………………………………………….…… 26
3-5-3- Inhibiteurs énergétiques fongiques…...…………………………………………………………… 27
3-5-3-1- Ciclopiroxolamine……………….…………………………………………………….…… 27
3-5-4- Les allylamines………………………………………………………………………………….…… 27
3-5-4-1- La terbinafine ………………………………………………………………………………. 27
3-5-5- Les morpholines………………………………………………………………………………...…… 28
3-5-5-1- L’amorolfine………………………………………………………………………………… 28

3-6- Evaluation des activités biologiques des benzohiazoles………………………………………….… 28
3-5-1- Activités biologiques………………………………………………………………………………… 28
3-6-1-1- Activité antimorale……………………………………………………………………….… 28
3-6-1-2- Activité antisécrétoire gastrique………………..………………………………………… 29
3-6-1-3- Activité antiparasitaire…………………………..……………………………………....… 29

4- Anti-leucémiques…………………………………………………………………………………………. 30

4-1- Définition de la leucémie…………………………………………………………………………………… 30

4-2- Introduction aux anti-leucémiques………………………………………………………………………. 30

4-3- Les anti-leucémiques classiques utilisés dans le traitement des leucémies………………..…... 31

4-4- La recherche des nouveaux traitements anti-leucémiques…………………………………...…..… 32
4-4-1- Les anti-leucémiques récents……………………………………………………………..…..…… 32
4-4-2- Les nouvelles anthracyclines…...………………………………………………………………..… 34
a) L’idarubicine……………………………………………………………………………………..… 34
b) La daunorubicine encapsulée……..……………………………………………………..……… 34
4-4-3- Les inhibiteurs de la topoisomérase-1……………………………………………………………. 35
4-4-4- Agents ciblants les antigenes de la surface céllulaire…………………………………………. 36
4-4-4-1- Traitement des anticorps anti – CD33…………………………………………………… 36
4-4-4-2- Autres traitements par des anticorps monoclonaux……………………………………. 37
4-4-5- Autres nouvelles antileucemiques molécules…………………………………………………….. 37
4-4-6- La recherche de vaccin antileucemique…………………………………………………………... 38
4-4-7- Des composés arsénicaux…...…………………………………………………………………….. 39
Conclusion de la synthèse bibliographique………………………………………………………………….

Chapitre II : Matériels et Méthodes
1- Choix des souches…………………………….…………………………….………………………………… 42
1-1- Choix et Identification des souches……………………..…….……………….….…………………… 43
1-2- Méthodes d’identification…………………………….…………………………….……………………. 43
1-2-1- La culture…………………………….…………………………….…………………………………. 43
1-2-2- L’incubation…………………………….…………………………….………………………………. 43
1-2-3- La lecture…………………………….…………………………….…………………………………. 43
1-2-4- L’identification…………………………….…………………………….……………………………. 44
1-2-5- L’examen macroscopique…………………………….…………………………….………………. 44
1-2-6- L’examen microscopique…………………………….…………………………….……………….. 44

2- La mise en œuvre de la fermentation…………………………….…………………………….………….. 45
2-1- Préparation du milieu…………………………….…………………………….………………………… 45
2-2- Préparation des inoculums et ensemencement du milieu………………………………………….. 45

3- L’incubation…………………………….…………………………….………………………………………… 46

4- Détection de la production d’antibiotique par des souches identifiées……………………………... 46
4-1- Le test biologique (Bio essai) …………………………….…………………………………………….. 46
4-2- Etude de la croissance…………………………….…………………………….………………………. 47
4-3- Caractérisation des antibiotiques produits…………………………………………………………….. 47
4-3-1- Méthode de chromatographie…………………………….………………………………………... 47
4-3-2- Bioautographie….………………………….…………………………….………………………….. 48
4-3-4- Bioautographie appliqué à un antibiotique témoin……………………………………………….. 49

Chapitre III : Résultats et discussions
1- L’identification des souches de Dermatophyles…………………………………………………………. 50

2- Mise en évidence de la production d’antibiotiques et étude de la croissance……………………... 52
2-1- Le test biologique…………………………….…………………………….…………………………….. 52
2-2- Etude de la croissance des souches productrices…………………………….………………...…… 55

3- Caractérisation des antibiotiques produits «Bioantographie» ………………………………….……. 56

Chapitre III : Application 1 : Substance Antibactériennes Antifongiques
1- Préparation des souches testées…………………………………………………………………..………. 60
1-1- Choix et identification des souches fongiques…………………………….……………………….…. 60
1-2- Provenance des souches…..……………………….………………………………………….………. 60
1-3- Méthode d’identification………...………………….…………………………….……………………… 60
1-3-1- Identification des souches des champignons…………………………….………………………. 61
a)- L’examen macroscopique…………………………….…………………………………………. 61
b)- L’examen microscopique…………………………….…………………………………….……. 61
1-3-2- Choix et identification des souches bactériennes…………………………….……………..…… 62
1-3-3- Préparation des souches bactériennes……………………………………………………...……. 62

2- Préparation de la pénicilline – like et l’acide kojique – like…………………………….………………. 63
2-1- Source des substances actives testées…………………………………………………………….…. 63
2-2- La détermination de la C.M.I……………………………………………………………………………. 63
2-3- La méthode de dilution…………………………….……………………………………………….……. 63
2-4- La préparation de l’inoculation bactérien………………………………………………………………. 63
2-5- La préparation des dilutions des antibiotiques à tester………………………………………………. 64
2-5-1- La méthode de dilution en milieu liquide………………………………………………………….. 64
2-5-2- La méthode de diffusion sur gélose……………………………………………………………….. 64
2-5-3- Préparation des disques……………………………………………………………………………. 65
2-5-4- Préparation de la suspension des spores………………………………………………………… 65
2-6- La méthode de diffusion en milieu solide (antibiogramme)………………………………………….. 66
2-6-1- Application sur des souches bactériennes…...…………………………………………………... 66
2-6-2- Application sur des souches fongiques…………………………………………………………… 66
2-6-3- La méthode des puits……………………………………………………………………………….. 66
2-6-4- L’incubation…………………………….…………………………….………………………………. 66
2-7- Lecture des résultats…………………………….…………………………….……………………….... 67
2-7-1- Résultats de dilution en milieu liquide……………………………………………………….……. 67
2-7-2- Résultats de diffusion par la méthode des disques et des puits……………………………….. 67
2-7-3- Interprétation des résultats…………………………………………………………………………. 67

3- Résultats et Interprétations…..………………………….……………………………………………..……. 68
3-1- La méthode de dilution en milieu liquide…………………………….…………………………...……. 68
a)- L’acide kojique – like…………………………….………………………………………………. 69
b)- La pénicilline – like…………………………….…………………………………………………. 69
3-2- La méthode de diffusion sur milieu solide…………………………….………………………….……. 69
3-3- Résultats avec les souches bactériennes…………………………………………………………….. 70
3-4- Résultats avec les souches de champignons……………………….……...………………………… 70

Chapitre III : Application 2 : Application anti-leucémique
1- Tests in-vitro…..……………………….…………………………….…………………………….…………... 79
1-1- Provenances des échantillons sanguins…………………………….………………………………… 79
1-2- Préparation des souches actives…………………………….…………………………………………. 79
a)- Régulation du pH…………………………….…………………………………………………... 80
b)- La dilution des substances…………………………….…………………………….………….. 80
1-3- La détermination de la structure chimique des deux substances (A et B)…………………………. 80
1-3-1- Concentration de l’extrait protéique…………………………….…………………………………. 80
1-3-2- Le principe de la méthode…………………………….…………………………….……………… 81
1-3-3- Centrifugation des concentras……………………………………………………………………... 82
1-3-4- La détermination de la structure chimique par (IR) ………...…………………………………… 82
1-3-5- La technique d’analyse……………………………………………………………………………… 83
1-4- Les tests sur des échantillons sanguins…………….….........……………………………………….. 83
1-4-1- Prélèvements sanguins……………………………………………………………………………... 83
1-4-2- Tests hématologiques sur les échantillons sanguins……………………………………………. 83
a)- Méthodes de numération des globules blancs……………………………………………….. 83
b)- Méthodes de numération des globules rouges……………………………………………….. 84
c)- Le dosage d’hémoglobine……………………………………………………………………….. 85
d)- Le frottis sanguin……..…………………………….……………………………………………. 85
1-5- Tests avec les substances (A) et (B) ………………………...………….……………………...…….. 87

2- Les Tests in-vivo……………………..…………..…………..…………..…………..…………..……………. 87
2-1 -L’injection Intraveineuse des deux Substances…………..…………..…………..………………… 87
2-2 -Les Tests Réalisés Sur Le Sang Des Lapins…………..…………..…………..…………..………… 88
2-2-1 -Tests Hématologiques…………..…………..…………..…………..…………..…………..…….. 88
2-2-2 - Tests Biochimiques…………..…………..…………..…………..…………..…………………… 88
2-2-2-1 -Mesure de glycémie (méthode enzymatique colorimétrique) …………..…………… 88
2-2-3 -La mesure de la créatinine…………..…………..…………..…………..………………………... 89
2-2-4-La mesure du cholestérol total (méthode enzymatique – colorimétrique) …………..………... 91
2-2-5-La mesure des triglycérides (méthode enzymatique colorimétrique) …………………………. 91

3- Résultats des Tests In-vitro…………..…………..…………..…………..…………..…………………….. 92
3-1- L’évaluation de l’activité des deux substances actives sur les lignées leucocytaires……………. 92
3-2- Interprétation Des Résultats Des Tableaux 16 ; 17 ; 18. …………..…………..…………………… 92

3-3-L’influence De La substance (A) produite par T.violacuim prise en différentes dilutions sur la
lignée érythrocytaire……………………………………………………………………………………….… 97
3-4- Interprétation Des Résultats Des Tableaux 19 ; 20 ; 21……………………………………………. 97
3-5- L’influence De La Substance (B) Sur Les Lignées Leucocytaires Et Erythrocytaires…………... 101
3-6- L’influence De La Substance (B) produite par T.verrucosum prise en différentes dilutions sur
la lignée leucocytaire………………………………………………………………………………………... 101
3-7- Interprétation Des Résultats Des Tableaux 22 ; 23 ; 24……………………………………………. 101
3-8 L’influence De La Substance (B) Produite Par T.verrucosum Prise En Différentes Dilutions Sur
La Lignée Erythrocytaire………………………………………………………………………………..…… 105
3-9- Interprétation Des Résultats Des Tableaux 25 ; 26 ; 27……………………………………….…… 105
3-10- Commentaire Des Frottis Sanguins…………………………....………………………………….... 109

4- Tests In-vivo…………………………………………………………………………………………………… 109
4-1 Résultats et interprétations…………………………………………………………………………….. 109
4-1-1- Les Effets De L’injection De La substance (B) à Différentes Doses Sur L’organisme Du
Lapin..................................………..…………..…………..…………..…………................................. 110
4-2- Résultats et interprétations………………………………………………..………………………….. 116
4-2-1- Les Effets De L’injection De La substance (A) à Différentes Doses Sur L’organisme Du
Lapin…………………………………………………………………………….………………………….. 116

Conclusion générale
Annexes
Références bibliographiques
LISTE DES TABLEAUX

Les Tableaux Pages
Tableau 1 : Classification d’Emmons (1934)………………………………………………………………... 06
Tableau 2 : Différentes espèces de Dermatophytes pathogènes classés par (Ajello, et al, 1980)…… 06
Tableau 3 : Classification des Dermatophytes d’après Zagnoli et al (2005)…………………………….. 07
Tableau 4 : Classification générale des antibiotiques d'après (Christophe 2003)………………………. 15
Tableau 5 : Les principaux antifongiques selon (Koenig 1995)…………………………………………… 21
Tableau 6 : Caractères différentiels des différentes souches…………………………………………….. 51
Tableau 7 : Valeurs des RF de chaque antibiotique par rapport aux quatre solvants………………….. 56
Tableau 8 : Influence de la substance similaire à l’acide kojic-like produite par la S7 sur les souches 72
bactériennes (la dilution en milieu liquide)……………………………………………………………………
Tableau 9 : Influence de la substance (S1) penicilline-like sur des bactéries mesurées par 73
spectrophotomètre……………………………………………………………………………………………….
Tableau 10 : Influence des antibiotiques-like sur les bactéries Diffusion sur milieu solide : disques... 74
Tableau 11 : Influence des antibiotiques-like sur les bactéries Diffusion sur milieu gélosé : puits……. 75
Tableau 12 : Influence des antibiotiques-like sur les souches de champignons. Diffusion sur milieu 76
solide : disques…………………………………………………………………………………………………..
Tableau 13: Influence des antibiotiques-like sur les souches de champignons. Diffusion sur milieu 77

solide : puits………………………………………………………………………………………………………
Tableau 14 : Zone de concentration à différentes saturations de sels pour la solution A……………… 81
Tableau 15 : Zone de saturation à différentes concentrations de sels pour la solution B…………….... 82
Tableau 16 : L’influence de la substance (A) prise en différentes dilutions sur les lignées 94
leucocytaires des leucémiques non traitées…………………………………………………………………
Tableau 17 : L’influence de la substance (A) prise en différentes dilutions sur les lignées 95
leucocytaires des leucémiques en rémission…………………………………………………………………
Tableau 18 : L’influence de la substance (A) prise en différentes dilutions sur les lignées 96
leucocytaires des sujets normaux……………………………………………………………………………..
Tableau 19 : L’influence de la substance (A) prise en différentes dilutions sur les lignées 97
érythrocytaires des leucémiques non traitées………………………………………………………………..
Tableau 20: L’influence de la substance (A) prise en différentes dilutions sur les lignées 99
érythrocytaires des leucémiques en rémission complète…………………………………………………...
Tableau 21 : L’influence de la substance (A) prise en différentes dilutions sur les lignées 100
érythrocytaires des sujets normaux……………………………………………………………………………
Tableau 22 : L’influence de la substance (B) prise en différentes dilutions sur les lignées 102
leucocytaires des leucémiques non traitées………………………………………………………………….
Tableau 23: L’influence de la substance (B) prise en différentes dilutions sur les lignées 103
leucocytaires des leucémiques en rémission complète……………………………………………………..
Tableau 24: L’influence de la substance (B) prise en différentes dilutions sur les lignées 104
leucocytaires des sujets normaux……………………………………………………………………………..
Tableau 25 : L’influence de la substance (B) prise en différentes dilutions sur les lignées 106
érythrocytaires des leucémiques non traitées………………………………………………………………..
Tableau 26 : L’influence de la substance (B) prise en différentes dilutions sur les lignées 107
érythrocytaires des leucémiques en rémission complète…………………………………………………...
Tableau 27 : L’influence de la substance (B) prise en différentes dilutions sur les lignées 108
érythrocytaires des sujets normaux……………………………………………………………………………
Tableau 28 : Les paramètres hématologiques et biochimiques avant et après l’inoculation de la 113
substance (B) pure à la dose de 1ml/kg chez le lapin……………………………………………………….
Tableau 29 : Les paramètres hématologiques et biochimiques avant et après l’inoculation de la 114
substance (B) pure à la dose de 0,5 ml/kg chez le lapin……………………………………………………
Tableau 30: Les paramètres hématologiques et biochimiques avant et après l’inoculation de la 114
substance (B) pure à la dose de 0,25 ml/kg chez le lapin…………………………………………………..
Tableau 31 : Les paramètres hématologiques et biochimiques avant et après l’inoculation de la 115
substance (B) diluée (1/2) à la dose de 1ml/kg chez le lapin……………………………………………….
Tableau32: Les paramètres hématologiques et biochimiques avant et après l’inoculation de la 115
substance (B) diluée (1/2) à la dose de 0,5 ml/kg chez le lapin……………………………………………
Tableau 33 : Les paramètres hématologiques et biochimiques avant et après l’inoculation de la 118
substance (A) pure à la dose de 1ml/kg chez le lapin……………………………………………………….
Tableau 34 : Les paramètres hématologiques et biochimiques avant et après l’inoculation de la 119
substance (A) pure à la dose de 0,5 ml/kg chez le lapin…………………………………………………...
Tableau 35 : Les paramètres hématologiques et biochimiques avant et après l’inoculation de la 119
substance (A) pure à la dose de 0,25 ml/kg chez le lapin…………………………………………………..
Tableau 36 : Les paramètres hématologiques et biochimiques avant et après l’inoculation de la 120
substance (A) diluée (1/2) à la dose de 1ml/kg chez le lapin……………………………………………….
Tableau37 : Les paramètres hématologiques et biochimiques avant et après l’inoculation de la 120
substance (A) diluée (1/2) à la dose de 0,5 ml/kg chez le lapin……………………………………………
Résumé
La production d'antibiotiques par les Dermatophytes a été
démontrée dans une culture agitée de F.U.M (Fermentation Unit Medium).
Parmi 10 souches de Dermatophytes testées pour leur pouvoir
producteur d’antibiotiques, 04 souches seulement ont été trouvées
productrices. L'aboutissement à une identification qualitative des
antibiotiques produits , a été assuré par la chromatographie sur couche
mince et la méthode de classification de Betina. Quatre types d'antibiotiques
ont été alors révélés, une substance similaire à pénicilline produite par une
souche de Trichophyton mentagrophytes .
Deux substances antibiotiques différentes et inconnues, obtenues à
partir des deux autres souches de Trichophyton verruccosum;
Trichophyton violacium.
Une substance antibiotique similaire à l’acide kojique issue de la
souche Trichophyton gourvillii.
La détermination de la C.M.I. des deux substances identifiées : la
Pénicilline-like et l’acide kojique-like produites les souches S1 et S7; les essais
in- vitro ont été réalisés sur les Bactéries : E.coli; S.aureus; P.mirabilus;
A.feacalis et S. typhi et sur les Champignons T.interdigitales; M. audouinii;
E.floccosum; Penicillium sp et Aspergillus sp.
L’utilisation de techniques de dilution en milieu liquide et diffusion sur
gélose soit par la méthode de puits ou disques a permis de mettre en évidence
l’activité antibactérienne et antifongique des deux substances actives sur des
souches testées ; les C.M.I. mesurées sont comprises entre 10-1 et 10-3.
Les substances inconnues codées (A) et (B) produites par
respectivement par T.verruccosum et T.violaceum ont été étudiées pour leur
pouvoir anti-leucémiques.
Les tests in vitro ont démontré une puissance destructive des deux
substances sur la lignée leucocytaires. Par contre leur action est relativement
faible sur la lignée érythrocytaires.
Les tests in vivo sur des lapins ont prouvé l’absence de toxicité par le
simple fait que les lapins inoculés par les deux substances A et B ont continué
de vivre normalement.
Mots clés : Dermatophytes; Antibiotiques-like; Anti-leucémiques-like; Tests in -
vitro et in -vivo.