Antonio López Gómez

205 Pages·2012·4.94 MB·English

UNIVERSITAT DE LES ILLES BALEARS
FACULTAT DE CIÈNCIES
DEPARTAMENT DE BIOLOGIA
Doctorat per la UIB de Microbiologia Ambiental
i Biotecnologia

Estudio de la variabilidad genética, factores de
virulencia y mecanismos de invasión del epitelio
respiratorio humano durante la infección por
Haemophilus influenzae no tipable

TESIS DOCTORAL

Antonio López Gómez

Palma, 2012

Directora: Dra. Juncal Garmendia García

Tesis Doctoral presentada por D. Antonio López Gómez para aspirar al grado de
Doctor por la Universidad de las Islas Baleares.

D. Antonio López Gómez
(Nombre del doctorando)

La Dra. Juncal Garmendia García como directora, y el Dr. José Antonio Bengoechea
Alonso como co-director, de la Tesis Doctoral titulada “Estudio de la variabilidad
genética, factores de virulencia y mecanismos de invasión del epitelio respiratorio
humano durante la infección por Haemophilus influenzae no tipable”, realizada en la
Fundación de Investigación Sanitaria de las Islas Baleares (FISIB) por D. Antonio
López Gómez, autorizan la presentación de la mencionada Tesis Doctoral puesto que
reúne las condiciones necesarias para su defensa.

Dra. Juncal Garmendia García Dr. José Antonio Bengoechea Alonso
(Directora de la Tesis Doctoral) (Co-director de la Tesis Doctoral)

Dr. Jorge Lalucat Jo
(Ponente de la Tesis Doctoral)
Este trabajo de Tesis Doctoral ha sido realizado gracias al disfrute de una Beca
Predoctoral de Personal Investigador Oferta Año 2008 (BOIB núm. 65 de 13/5/2008)
Referencia FP108 4313370P asociada al proyecto:
- FIS (Fondo de Investigaciones Sanitarias) con referencia PS09-00130: “Disección
molecular de la colonización del epitelio respiratorio por el patógeno bacteriano
Haemophilus influenzae no tipable”
ÍNDICE GENERAL

ÍNDICE DE FIGURAS…………………………………………………………………………9
ÍNDICE DE TABLAS…………………………………………………………......................11
ABREVIATURAS……………………………………………………………………………..13
RESUMEN / ABSTRACT……………………………………………………......................18
INTRODUCCIÓN……………………………………………………………………………..23
1. BASES DE LA PATOGÉNESIS BACTERIANA……………………………………....23
1.1. Factores de virulencia bacteriana……………………………………………………..26
1.2. Papel de la modificación y del intercambio de material genético en la virulencia
bacteriana……………………………………………………………………………………...27
1.3. Moléculas del hospedador moduladas durante la infección bacteriana…………..28
1.3.1 Integrinas………………………………………………………………………………..28
1.3.2. Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule (CEACAM)………....30
1.3.3. Balsas lipídicas y rutas endocíticas………………………………………………....30
1.3.4. Citoesqueleto de la célula hospedadora…………………………………………....32
i) Citoesqueleto de actina…………………………………………………………………..32
ii) Microtúbulos…………………………………………………………………………….....32
iii) Guanine triphosphatase (GTPasas)………………………………………………….....33
1.3.5. Fosfoinosítidos…………………………………………………………………………37
2. ESTRUCTURA Y CARACTERÍSTICAS GENERALES DEL TRACTO
RESPIRATORIO…………………………………………………………………………..38
2.1. Inmunidad innata humoral y celular del tracto respiratorio………………………….41
2.2. Microbiota normal del tracto respiratorio……………………………………………...46
2.3. Aspectos generales de la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC)......47
3. Haemophilus influenzae NO TIPABLE: UN PATOGENO OPORTUNISTA DEL
TRACTO RESPIRATORIO HUMANO……………………………………………………..48
3.1. Características generales de Haemophilus influenzae………................................48
3.2. Dualidad colonizador-patógeno de Haemophilus influenzae……………………….49
3.3. Variabilidad genética de H. influenzae……………………………………………......52
3.4. Factores de virulencia y mecanismos de patogénesis de HiNT……………………54
3.4.1. El lipooligosacárido de HiNT: estructura, diversidad e implicación en
virulencia……………………………………………………………………………………….54
5
3.4.2. Resistencia de HiNT a la muerte mediada por péptidos antimicrobianos…......61
3.4.3. Formación de biopelículas por HiNT……………………....................................62
3.5. Elementos bacterianos y dinámica de la infección epitelial por HiNT…………….64
3.5.1. Moléculas implicadas en la interacción de HiNT en el epitelio respiratorio
humano………………………………………………………………………………………..65
3.5.2. Características de la interacción de HiNT con células respiratorias…………….68
HIPÓTESIS Y OBJETIVOS………………………………………………………………...71
MATERIAL Y MÉTODOS…………………………………………………………………..75
1. CEPAS BACTERIANAS, MEDIOS Y CONDICIONES DE CULTIVO……………...76
2. INMUNODETECCIÓN DE PCho A PARTIR DE COLONIA (COLONY BLOT)……76
3. EXTRACCIÓN, RESTRICCIÓN Y MODIFICACIÓN DE ADN………………………77
4. REACCIÓN DE LA POLIMERASA EN CADENA (PCR)…………………………….78
5. TRANSFORMACIÓN QUÍMICA DE E. coli……………………………………………79
6. TRANSFORMACIÓN DE H. INFLUENZAE MEDIANTE INDUCCIÓN DE LA
COMPETENCIA NATURAL (MÉTODO M-IV)……………………………….............79
7. GENERACIÓN DE CEPAS MUTANTES DE HiNT…………………………………..80
8. DETERMINACIÓN DE LA FORMACIÓN DE BIOPELÍCULAS POR HiNT
MEDIANTE FLUJO CONTINUO……………………………………………................83
9. DETERMINACIÓN DE LA RESISTENCIA DE HiNT A PÉPTIDOS
ANTIMICROBIANOS…………………………………………………………………….84
10. ENSAYO DE AGREGACIÓN BACTERIANA………………………………………..84
11. CULTIVO CELULAR, MANTENIMIENTO DE LÍNEAS CELULARES E INFECCIÓN
DE CÉLULAS EN CULTIVO…………………………………………………………..85
12. TRANSFECCIONES TRANSITORIAS………………………………………………..89
13. TINCIÓN Y MICROSCOPÍA DE FLUORESCENCIA……………………………….91
14. MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA DE BARRIDO…………………………………....91
15. ANÁLISIS DE PROTEÍNAS MEDIANTE ELECTROFORESIS EN GEL DE
POLIACRILAMIDA CON SDS (SDS-PAGE) Y WESTERN BLOT………………...92
16. INFECCIÓN INTRANASAL DE RATONES CD1…………………………………….93
17. ANÁLISIS ESTADÍSTICO……………………………………………………………...94
RESULTADOS……………………………………………………………………………….96
6
CAPÍTULO 1: ANÁLISIS DE LA CONTRIBUCIÓN RELATIVA DE LAS
MODIFICACIONES DE LA MOLÉCULA DE LIPOOLIGOSACÁRIDO A FENOTIPOS
ASOCIADOS A LA PATOGÉNESIS DE HiNT…………………………………………..97
1.1. Respuestas del hospedador a la infección por aislados clínicos de HiNT de
pacientes respiratorios crónicos……………………………………………………………97
1.1.1. Resistencia de aislados clínicos de HiNT al ataque bactericida de péptidos
antimicrobianos………………………………………………………………………………98
1.1.2. Interacción de aislados clínicos de HiNT con el epitelio respiratorio
humano……………………………………………………………………………………...102
1.1.3. Formación de biopelículas de aislados clínicos de HiNT sobre superficies
abióticas……………………………………………………………………………………..104
1.2. Análisis de la contribución relativa de las sustituciones del LOS de HiNT a
fenotipos asociados a patogénesis mediante la caracterización de cepas
mutantes…………………………………………………………………………………….106
1.2.1. Contribución relativa de sustituciones del LOS a la resistencia de HiNT al
ataque bactericida de péptidos antimicrobianos….…………………….......................107
1.2.2. Contribución relativa de sustituciones del LOS de HiNT a la formación de
biopelículas sobre superficies abióticas…………………………………………………109
CAPÍTULO 2: DISECCIÓN DE LOS MECANISMOS DE SUBVERSIÓN CELULAR Y
DE LA CONTRIBUCIÓN RELATIVA DE ADHESINAS BACTERIANAS DURANTE LA
INFECCIÓN POR EL PATÓGENO RESPIRATORIO HiNT………………………….112
2.1. Contribución de las balsas lipídicas, integrinas, quinasas, GTPasas, señalización
dependiente de PI3K-Akt y [AMPc] a la infección del epitelio respiratorio humano por
HiNT…………………………………………………………………………………………112
2.1.1. Observación de la adhesión e invasión epitelial por HiNT mediante microscopía
electrónica de barrido……………………………………………………………………...112
2.1.2. Papel de balsas lipídicas, caveolina y clatrina en la invasión del epitelio
respiratorio humano por HiNT…………………………………………………………….113
2.1.3. La actividad Akt es importante en la invasión del epitelio respiratorio humano por
HiNT………………………………………………………………………………………….119
2.1.4. Las integrinas β1 y α5 están implicadas en la invasión del epitelio respiratorio
humano por HiNT…………………………………………………………………………..123
2.1.5. Las tirosina quinasas están implicadas en la invasión del epitelio respiratorio por
HiNT………………………………………………………………………………………….124
2.1.6. Contribución de GTPasas de la familia Rho en la invasión epitelial por
HiNT………………………………………………………………………………………….129
7
2.1.7. Los niveles de AMP cíclico eucariota modulan la invasión de HiNT en el epitelio
respiratorio…………………………………………………………………………………..135
2.1.8. La fosforilación de Akt en células A549 infectadas por HiNT depende de Src y
Rac1……………………………………………………………………………………........136
2.1.9. Papel de RhoA en la invasión del epitelio respiratorio por HiNT375……….....136
2.2. Análisis de la contribución relativa de las adhesinas PCho, P5 y Hap, a la
infección por HiNT…………………………………………………………………………..138
2.2.1. Análisis de la variabilidad entre aislados clínicos en la dinámica de la interacción
entre HiNT y el epitelio pulmonar humano……………………………………………….138
2.2.2 Análisis de la contribución de las adhesinas PCho P5 y Hap de HiNT a fenotipos
asociados a patogénesis mediante la caracterización de cepas mutantes…………..141
2.2.2.1. Contribución relativa de adhesinas de HiNT en estadios iniciales de la
infección.……………………………………………………………………………………..142
2.2.2.2. Contribución relativa de adhesinas de HiNT en la infección in vivo mediante el
empleo de un modelo de infección intranasal murina………..…………………………146
DISCUSIÓN………………………………………………………………………………….150
1. RESPUESTAS DEL HOSPEDADOR A LA INFECCIÓN POR LOS AISLADOS
RESPIRATORIOS CRÓNICOS DE HiNT Y POR MUTANTES TRUNCADOS EN EL
LIPOOLIGOSACÁRIDO…………………………………………………………………154
2. MECANISMOS MOLECULARES IMPLICADOS EN LA INVASIÓN EPITELIAL POR
HiNT……………………………………………………………………………………….157
3. PAPEL DE P5, PCho Y HAP EN LA INFECCIÓN POR HiNT………………………165
CONCLUSIONES………………………………………………………………………......168
REFERENCIAS……………………………………………………………………………..172
ANEXOS……………………………………………………………………………………..198
ANEXO I: CEPAS, CEBADORES, PLÁSMIDOS, INHIBIDORES FARMACOLÓGICOS
dsRNA Y ANTICUERPOS EMPLEADOS EN ESTE TRABAJO……………………….199
ANEXO II: PUBLICACIONES……………………………………………………………...209

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