Analysis of adhesive and repulsive functions of FLRT proteins in central nervous system ...

168 Pages·2015·16.45 MB·English

Analysis of adhesive and repulsive
functions of FLRT proteins in
central nervous system development

Daniel Matthias Nagel
München 2014

Analysis of adhesive and repulsive
functions of FLRT proteins in
central nervous system development

Dissertation of the Graduate School
of Systemic Neurosciences
Ludwig-Maximilians Universität, München

Daniel Matthias Nagel

Supervisor      Prof. Rüdiger Klein 
Second reviewer    Prof. Stephan Kröger 
Third reviewer    Prof. Victor Tarabykin 
Date of oral defense:   14.01.2015

Für Christine und Matilda

Table of Contents 

1.  Introduction  1 
1.1.  Structure and development of the cerebral cortex  3 
1.2.  Generation and migration of cortical projection neurons  8 
1.3.  Molecular regulation of neuronal migration  11 
1.4.  Cell adhesion in synapse formation  15 
1.5.  Leucine‐rich repeat proteins in nervous system development  19 
1.6.  The fibronectin‐leucine‐rich‐repeat‐transmembrane (FLRT) family of proteins  21 
1.7.  Aims of the study  27 
2.  Results  29 
2.1.  Involvement of FLRT family members in synapse formation  29 
2.1.1.  FLRTs are enriched in synaptic fractions in vivo  29 
2.1.2.  FLRTs do not induce pre‐ or postsynaptic differentiation in a mixed culture assay  31 
2.1.3.  FLRT1 and FLRT3 do not regulate excitatory synapse number in primary hippocampal 
neurons  37 
2.1.3.1.  Genetic knock‐out of FLRT1 or FLRT3 does not change excitatory synapse number 
  in vitro  37 
2.1.3.2.  Sparse knock‐out of FLRT3 does not change excitatory synapse number in vitro  43 
2.1.3.3.  Overexpression of FLRT3 does not change excitatory synapse number in vitro  46 
2.1.4.  Knock‐out of FLRT1 and FLRT3 does not change expression of synaptic proteins in 
hippocampus in vivo  48 
2.1.5.  Knock‐out of FLRT3 does not change synapse density in the hippocampus in vivo  51 
2.2.  Involvement of FLRT family members in neuronal migration during cortex development  53 
I
2.2.1.  Generation of a variety of FLRT and Unc5 binding mutants based on crystal structures  53 
2.2.2.  Unc5D‐induced inhibition of migration is partially dependent on FLRTs  63 
2.2.3.  Loss of FLRT3 does not affect radial migration of neurons  67 
2.2.4.  Ectopic expression of FLRT2 or FLRT3 interferes with radial migration independently of 
Unc5s  70 
2.2.5.  Homophilic binding of FLRTs is involved in inhibiting radial migration  72 
2.2.6.  FLRT3 signaling is involved in the inhibition of migration  74 
2.2.7.  Overexpression of FLRT3 does not change cell fate  76 
3.  Discussion  78 
3.1.  FLRTs in synapse development  78 
3.2.  FLRT‐FLRT and FLRT‐Unc5 interactions occur via distinct surface domains and can be 
  uncoupled  83 
3.3.  FLRTs in cortical development  85 
3.3.1.  FLRT2 inhibits radial migration via Unc5D  86 
3.3.2.  Loss of FLRT3 does not influence radial migration  88 
3.3.3.  Overexpression of FLRTs inhibits radial migration by homophilic adhesion and via the 
intracellular domain  90 
3.3.4.  FLRT3 does not change cell fate of developing pyramidal neurons  95 
3.4.  Conclusions and outlook  97 
4.  Materials and Methods  99 
4.1.  Materials  99 
4.1.1.  Chemicals, reagents and kits  99 
4.1.2.  Buffers for biochemistry and stainings  99 
4.1.3.  Media for tissue culture  102 
4.1.4.  Oligonucleotides for genotyping  104 
4.1.5.  Plasmids  105 
II