Tierärztliche Hochschule Hannover Detektion dopingrelevanter anaboler Steroide in Pferdeurin ...

184 Pages·2011·1.64 MB·German

Tierärztliche Hochschule Hannover

Detektion dopingrelevanter anaboler
Steroide in Pferdeurin und Pferdeplasma mithilfe
eines Reportergen-Assays in Hefezellen

INAUGURAL – DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer Doktorin
der Veterinärmedizin
- Doctor medicinae veterinariae -
( Dr. med. vet. )

vorgelegt von
Verena Reupke
Brilon

Hannover 2011
Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. Manfred Kietzmann, Institut für
Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie

1. Gutachter: Prof. Dr. Manfred Kietzmann

2. Gutachter: Prof. Dr. Harald Sieme

Tag der mündlichen Prüfung: 17.11.2011

Die Arbeit wurde durch die Deutsche Reiterliche Vereinigung, FN gefördert.
Für meine Mutter
in memoriam

Inhaltsverzeichnis

1 EINLEITUNG........................................................................................1

2 LITERATURÜBERSICHT..................................................................3

2.1 Steroidhormone...................................................................................................3
2.2 Wirkmechanismus der Steroidhormone...........................................................8
2.3 Anabol androgene Steroide: Effekte und Nebenwirkungen..........................10
2.4 Anabol androgene Steroide: Pharmakokinetik..............................................12
2.5 Anabol androgene Steroide: Nachweis............................................................13
2.6 Bedeutung von Bioassays zum Nachweis anabol androgener Steroide........16
2.7 Doping beim Pferd: Rechtliche Grundlagen und Reglement........................21
2.8 Einsatz von Steroidhormonen beim Tier.........................................................24
2.8.1 Androgene und Antiandrogene.........................................................................24
2.8.2 Gestagene und Antigestagene..........................................................................24
2.8.3 Estrogene und Antiestrogene...........................................................................25

3 MATERIAL UND METHODE..........................................................26

3.1 Durchführung des Hefeassays............................................................................27
3.1.1 Herstellung der verwendeten Medien..............................................................27
3.1.2 Eingesetzte Testsubstanzen..............................................................................29
3.1.3 Kultivierung und Verwendung der Hefezellen................................................30

3.2 Etablierung des Hefeassays für Messungen in Pferdeurin und
Pferdeplasma.......................................................................................................31
3.2.1 Einzusetzende Urinkonzentration...................................................................31
3.2.2 Einzusetzende Plasmakonzentration...............................................................33
3.2.3 Anpassung des pH-Wertes in Pferdeurin........................................................35
3.2.4 Anpassung der Substratkonzentration (CPRG) im Kulturmedium.................36

3.3 Analyse von Pferdeurin und Pferdeplasma nach Zusatz verschiedener
Substanzen...........................................................................................................37

3.4 Untersuchung von Proben behandelter Pferde…………………....................38
3.4.1 Tiere................................................................................................................38
3.4.2 Applikation der Testsubstanzen......................................................................40
3.4.3 Probenentnahme..............................................................................................41
3.4.3.1 Urinproben................................................................................................41
3.4.3.2 Blutproben.................................................................................................43
3.4.4 Analyse der Proben im Hefeassay ohne Aufarbeitung...................................44
3.4.5 Analyse der Urinproben im Hefeassay nach Aufarbeitung............................44
3.4.5.1 Festphasenextraktionen.............................................................................45
3.4.5.2 Flüssigextraktion.......................................................................................46
3.4.5.3 Hydrolyse..................................................................................................46
. 3.5 Auswertung der Messdaten................................................................................47
3.6 Reagenzien und Geräte.......................................................................................48
3.6.1 Reagenzien.....................................................................................................48
3.6.2 Geräte.............................................................................................................51

4 ERGEBNISSE...................................................................................54

4.1 Optimierung der Methode für Pferdeurin........................................................55
4.1.1 Bestimmung der einzusetzenden Urinkonzentration......................................55
4.1.2 Anpassung des pH-Wertes in Pferdeurin........................................................60
4.1.3 Anpassung der Substratkonzentration (CPRG) im Kulturmedium.................64

4.2 Optimierung der Methode für Pferdeplasma..................................................65
4.2.1 Bestimmung der einzusetzenden Plasmakonzentration...........................65
4.3 Analyse von Pferdeurin nach Zusatz verschiedener Substanzen..................69

4.4 Analyse von Pferdeplasma nach Zusatz verschiedener Substanzen............75

4.5 Analyse von Urinproben……………………....................................................77
4.5.1 Natürliche Hintergrundaktivität.....................................................................77
4.5.2 Einfluss der Zyklusaktivität...........................................................................81
4.5.3 Untersuchung von Urinproben behandelter Pferde........................................83
4.5.3.1 Untersuchung ohne Aufarbeitung........................................................83
4.5.3.2 Untersuchung nach pH-Anpassung......................................................87
4.5.3.3 Festphasenextraktionen........................................................................92
4.5.3.4 Flüssigextraktion..................................................................................94
4.5.3.5 Konjugatspaltung.................................................................................97

4.6 Analyse von Plasmaproben behandelter Pferde...........................................101

4.7 Analyse mittels chromatographischer Verfahren.........................................103
4.7.1 Urinproben....................................................................................................103
4.7.2 Plasmaproben................................................................................................106

5 DISKUSSION.................................................................................108

5.1 Optimierung der Methode für das Pferd: Eingesetzte Urin-
konzentration und Eigenschaften des Kulturmediums.............................108

5.2 Optimierung der Methode für das Pferd: Eingesetzte
Plasmakonzentration.....................................................................................110

5.3 Analyse von Pferdeurin und Pferdeplasma nach Zusatz verschiedener
Substanzen......................................................................................................111
5.4 Natürliche Hintergrundaktivität in Urinproben unbehandelter
Pferde..............................................................................................................117

5.5 Analyse von Urinproben behandelter Pferde..............................................121
5.5.1 Applikation von Nandrolon.........................................................................121
5.5.2 Applikation von Testosteronenanthat..........................................................122

5.6 Probenvorbereitung durch pH-Anpassung.................................................125

5.7 Probenvorbereitung durch Konjugatspaltung...........................................126

5.8 Probenaufarbeitung durch Extraktionen...................................................127
5.8.1 Festphasenextraktionen...............................................................................127
5.8.2 Flüssigextraktion.........................................................................................128

5.9 Analyse von Plasmaproben behandelter Pferde..........................................128

5.10 Vor- und Nachteile des Hefeassays................................................................129

5.11 Fazit………………………………………………………………………….132

6 ZUSAMMENFASSUNG...............................................................133

7 SUMMARY....................................................................................135

8 LITERATURVERZEICHNIS.....................................................137

9 ANHANG.......................................................................................153
Abkürzungsverzeichnis

°C Grad Celsius
µg Mikrogramm
µl Mikroliter
µm Mikrometer
% Prozent
Abb. Abbildung
ADMR Anti-Doping-Medikations-Kontrollregeln
ARE Androgen-responsive Elemente
Aqua bidest. Aqua bidestillata
Aqua dest. Aqua destilatum
AR-LUX-Assay Androgenrezeptor-Luciferase-Assay
bzw. beziehungsweise
ca. circa
CPRG Chlorphenolrot-ß-D-Galactopyranosid
d.h. das heißt
DHEA Dehydroepiandrosteron
DHT Dihydrotestosteron
DMSO Dimethylsulfoxid
DNA/DNS Desoxyribonukleinsäure
DVR Direktorium für Vollblutzucht und Rennen
E.coli Escherichia coli
EHSLC European Horserace Scientific Liaison
Committee
et al. et alii, und andere
FEI Fédération Equestre International
FN Fédération National
G Gramm
G Gauge
GC Gaschromatographie
GC-HRMS gas chromatography - high resolution mass
spectrometry
GFP green fluorescent protein
GnRH Gonadotropin-Releasing-Hormon
hAR humaner Androgenrezeptor
hCG humanes Choriongonadotropin
HPLC high performance liquid chromatography
Hsp Hitzeschockprotein
HVT Hauptverband für Traberzucht
IOC International Olympic Committee
L Liter
LH luteinisierendes Hormon
LOD limit of detection
LOQ limit of quantification
LPO Leistungs-Prüfungs-Ordnung
Mg Milligramm
Min Minute
Ml Milliliter
Mm Millimeter
MRL maximum residue level
MS Massenspektrometrie
Ng Nanogramm
Nm Nanometer
OD optische Dichte
p.a. pro analysi, für analytische Zwecke
PBS phosphate buffered saline
Pg Pikogramm
puriss. purissimum, besonders reine Qualität
Rpm rotations per minute
S Stute
SHBG Sexualhormon-bindendes Globulin