tc gazi üniversitesi sağlık bilimleri enstitüsü farmasötik teknoloji ana bilim dalı doksisiklinin lipozo

197 Pages·2010·1.83 MB·English

T.C.
GAZİ ÜNİVERSİTESİ
SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
FARMASÖTİK TEKNOLOJİ ANA BİLİM DALI

DOKSİSİKLİNİN LİPOZOM VE NANOPARTİKÜL FORMÜLASYONLARININ
GELİŞTİRİLMESİ VE HÜCRE KÜLTÜRÜNDEN GEÇİŞLERİNİN İNCELENMESİ

YÜKSEK LİSANS TEZİ

Ecz. Çiğdem YÜCEL

Tez Danışmanı
Doç. Dr. Zelihagül DEĞİM

Ankara
Temmuz 2010

İÇİNDEKİLER
Kabul ve Onay
İçindekiler I
Şekiller X
Tablolar XV
Şemalar XVIII
Kısaltmalar XIX

1.GİRİŞ 1
2.GENEL BİLGİLER 4
2.1.Glioblastoma Multiforme 4
2.1.1. Glioblastoma Multiforme Hastalığında
Tedavi Yaklaşımları 5
2.2. Kan Beyin Bariyeri 7
2.3. Matriks Metalloproteinazlar 8
2.3.1. Matriks Metalloproteinaz İnhibitörleri 11
2.4. Doksisiklin Hidroklorür 13
2.4.1.Fizikokimyasal Özellikler 14
2.4.1.1.Kimyasal yapısı ve Formülü 14
2.4.1.2.Fiziksel Özellikleri 14
2.4.1.3.Çözünürlük 14
2.4.2.Doksisiklinin Etki Mekanizması 14
2.4.3. Doksisiklinin Kullanım Alanları 15
2.4.4. Farmakokinetik Özellikleri 17
2.4.4.1.Absorbsiyon 17
2.4.4.2.Dağılım 17
2.4.4.3.Metabolizasyon-Eliminasyon 17
2.4.4.4.Yan Etkileri 18
2.4.4.5.Miktar Tayini yöntemleri 18
2.4.5.Doksisiklinin Avantajları 19
2.4.6.İlaç Etkileşimleri 19
I
2.4.7.Ticari Preparat Örnekleri 20
2.5.Lipozomlar 20
2.5.1.Lipozomların Sınıflandırılması 22
2.5.1.1.Özel Karakterli Lipozomlar 22
2.5.2.Lipozomların Hazırlanma Yöntemleri 23
2.5.3.Lipozomların Hazırlanmasında Kullanılan
Fosfolipitler 25
2.5.4.Lipozomal Bileşenlerin Kimyasal Analizi 26
2.5.5.Lipozomların Avantajları 26
2.5.6.Lipozomların Hücre Etki Mekanizmaları 27
2.5.7.Lipozomların Tedavide Kullanışı 27
2.5.8.Lipozomların Özellikleri(Karakterizasyonu) 29
2.5.9.Lipozomların Fizikokimyasal Özellikleri ve
Lipozomların Davranışlarını Etkileyen
Fizikokimyasal Özellikleri 29
2.5.10.Lipozomların Fiziksel Karakterizasyonunda
Kullanılan Teknikler 29
2.5.11.Lipozomların Sterilizasyonu 30
2.5.12.Lipozomların Kalite Kontrol Ölçümleri 30
2.5.13.Lipozomların Ticari Preparatlarına Örnekler 32
2.6.Nanopartiküller 33
2.6.1.Nanopartiküllerin Avantajları 33
2.6.2.Nanopartiküllerin Hazırlanmasında Kullanılan
Polimerler 34
2.6.3. Nanopartiküllerin Vücutta Hedeflenmesi, Dağılımı
ve Eliminasyonu 35
2.6.4. Nanopartiküllerin Tedavide Kullanılışları 37
2.6.5. Nanopartikül Dozaj Formunun Terapötik Uygulamaları 38
2.6.6. Nanopartiküllerin Hazırlanma Metotları ve
Kullanılan Polimerler 39
2.6.7. Nanopartikül Sterilizasyonu 40
II
2.6.8. Nanopartiküllerin İn vitro Karakterizasyonu 40
2.7. Hücre Kültürü 41
2.7.1. Hücre Kültürü Avantajları 42
2.7.2. Hücre Kültürünün Dezavantajları 42
2.7.3. Hücre Kültürü Ortamları 43
2.7.4. Hücre Kültürü Ortam Bileşenleri 43
2.7.5.Kültür Ortamının Fizikokimyasal Özellikleri 44
2.7.6. Hücre Kültürü Kullanım Alanları 45
2.7.7.Geçiş Çalışmalarında Kullanılan Sistemlere Örnekler 46
2.8.Caco-2 (Kolon Karsinoma) Hücreleri, Özellikleri ve
Kullanımları 46
2.8.1.İnce Bağırsaktan Geçiş 48
2.8.2.İntestinal Dokulardan İlaç Geçişinin Hücre Tek
Tabakalarıyla Kıyaslanması 49
2.8.3.Caco-2 Hücrelerinden İlaç Absorbsiyonunun
Değerlendirilmesinde Kullanılacak İlaca Ait Moleküler Özellikler 49
2.8.4.Caco-2 Hücrelerinin Bütünlüğünün ve Canlılığının
Değerlendirilmesi 49
2.9.Eudragit RS 100 Polimeri ve Özellikleri 50

3.GEREÇ ve YÖNTEM 51
3.1.GEREÇ 51
3.1.1.Kullanılan Kimyasal Maddeler 51
3.1.2.Kullanılan Aletler ve Malzemeler 52
3.2.YÖNTEM 53
3.2.1.Doksisiklin HCl’in Miktar Tayini Yönteminin Geliştirilmesi 53
3.2.2.Doksisiklinin Miktar Tayini Yönteminin Validasyonu 53
3.2.2.1.Doğrusallık 54
3.2.2.2.Doğruluk ve Geri Elde 54
3.2.2.3.Kesinlik 54
3.2.2.4.Özgünlük ve Seçicilik 55
III
3.2.2.5.Duyarlılık ve Saptama Sınırı 56
3.2.3.UV’de Sodyum Taurokolat Miktar Tayini Metot Validasyonu 56
3.2.3.1.Doğrusallık 56
3.2.3.2.Doğruluk ve Geri Elde 57
3.2.3.3.Kesinlik 57
3.2.3.4.Özgünlük ve Seçicilik 57
3.2.3.5.Duyarlılık ve Saptama Sınırı 58
3.2.4.MTT Testi 58
3.2.5.İn vitro Çalışmalarda Kullanılan Formülasyonlar 62
3.2.5.1.İn vitro Çalışmalarda Kullanılan Lipozomların
Hazırlanması 62
3.2.5.2. İn Vitro Çalışmalarda Kullanılan Lipozomların
Karakterizasyonu 63
3.2.5.2.1.Lipozomların Partikül Büyüklüğü ve Dağılımı 64
3.2.5.2.2.Lipozomların Şekli 64
3.2.5.2.3.Lipozom İçindeki Doksisiklin ve Sodyum Taurokolat
Miktar Tayinleri 64
3.2.5.2.4.Lipozomların Zeta Potansiyelleri 65
3.2.5.3.Lipozom Formülasyonuna Ait Stabilite Çalışmaları 65
3.2.5.3.1.Lipozom Formülasyonlarına Ait Stabilite Çalışmaları 65
3.2.5.3.2.Lipozom Formülasyonlarında Sodyum Taurokolat
Miktar Tayini 65
3.2.5.3.3.Lipozomların Partikül Büyüklüğü ve Dağılımları 65
3.2.5.3.4.Lipozomların Zeta Potansiyeli Ölçümleri 66
3.2.5.4.İn vitro Çalışmalarında Kullanılan Nanopartiküllerin
Hazırlanması 66
3.2.5.5. İn vitro Çalışmalarda Kullanılan Nanopartiküllerin
Karakterizasyonu 67
3.2.5.5.1.Nanopartiküllerin Partikül Büyüklüğü ve Dağılımı 67
3.2.5.5.2.Nanopartiküllerin Şekli 67
3.2.5.5.3.Nanopartikül İçindeki Doksisiklin ve Sodyum
IV
Taurokolat Miktar Tayinleri 67
3.2.5.5.4.Nanopartiküllerin Zeta Potansiyelleri 68
3.2.5.6.Nanopartiküllerin Formülasyonuna Ait Stabilite
Çalışmaları 68
3.2.5.6.1. Nanopartikül Formülasyonunda Doksisiklin
Miktar Tayini 68
3.2.5.6.2. Nanopartikül Formülasyonlarında Sodyum Taurokolat
Miktar Tayini 68
3.2.5.6.3. Nanopartiküllerin Partikül Büyüklüğü ve Dağılımları 68
3.2.5.6.4. Nanopartiküllerin Zeta Potansiyeli Ölçümleri 68
3.2.6.İn vitro Geçiş Çalışmaları 69
3.2.6.1.Hücre Kültürü Çalışmaları 69
3.2.6.1.1.Caco-2 Hücrelerinin Üretilmesi 69
3.2.6.1.2.Caco-2 Hücrelerinden Geçiş Çalışmaları 70
3.2.6.1.2.1.Doksisiklinin Geçirgenlik Katsayısının (k=Papp)
Hesaplanması 71
3.2.6.1.2.2.Hücrelerinin Elektriksel Dirençlerinin Ölçülmesi 72
3.2.6.1.3.Geçiş Çalışmalarında kullanılan Üzerinde Hücre
Bulunmayan Filtrelerden Geçiş Çalışmaları 72
3.2.6.2.Diyaliz Membran Geçişleri 72
3.2.6.3.Matriks Metalloproteinaz-2 (MMP-2) Tayini 73

4.BULGULAR 75
4.1.Doksisiklin HCl’e Ait Çalışmalarla İlgili Bulgular 75
4.1.1.UV Spektrumuna Ait Bulgular 75
4.1.2.UV Yöntemiyle Doksisiklinin Miktar Tayini Yönteminin
Validasyonuna Ait Bulgular 76
4.1.2.1.Doksisiklinin DMEM İçerisindeki Validasyonuna
Ait Bulgular 76
4.1.2.1.1.Doğrusallık 76
4.1.2.1.2.Doğruluk ve Geri Elde 77
V
4.1.2.1.3.Kesinlik 77
4.1.2.1.4.Özgünlük ve Seçicilik 79
4.1.2.1.5.Duyarlılık ve Saptama Sınırı 79
4.1.2.2.Doksisiklinin pH 7.4 Fosfat Tamponu İçindeki
Validasyonuna Ait Bilgiler 80
4.1.2.2.1.Doğrusallık 80
4.1.2.2.2.Doğruluk ve Geri Elde 80
4.1.2.2.3.Kesinlik 82
4.1.2.2.4.Özgünlük ve Seçicilik 83
4.1.2.2.5.Duyarlılık ve Saptama Sınırı 84
4.2.Sodyum Taurokolat’ın Spektrofotometrik Miktar
Tayini Yöntemini Validasyonuna Ait Bulgular 84
4.2.1.Doğrusallık 84
4.2.2.Doğruluk ve Geri Elde 85
4.2.3.Kesinlik 86
4.2.4.Özgünlük ve Seçicilik 87
4.2.5.Duyarlılık ve Saptama Sınırı 87
4.3.MTT Testine Ait Bulgular 88
4.4.Lipozom Formülasyonuna Ait Bulgular 91
4.4.1.Lipozomların Karakterizasyonuna Ait Bulgular 91
4.4.1.1.Lipozomların Partikül Büyüklüğü ve Dağılımına
Ait Bulgular 91
4.4.1.1.1.Doksisiklin Lipozomlarının Partikül Büyüklüğü ve
Dağılımına Ait Bulgular 91
4.4.1.1.2.Doksisiklin ve Sodyum Taurokolat Lipozomlarının Partikül
Büyüklüğü ve Dağılımına Ait Bulgular 94
4.4.1.2.Lipozomların Zeta Potansiyel Ölçümlerine Ait Bulgular 95
4.4.1.2.1.Doksisiklin Lipozomların Zeta potansiyel Ölçümlerine
Ait Bulgular 95
4.4.1.2.2.Doksisiklin ve Sodyum Taurokolat Lipozomların
Zeta Potansiyel Ölçümlerine Ait Bulgular 96
VI
4.4.1.3.Lipozomların Şekilleri 97
4.4.1.4.Lipozomlar İçindeki Doksisiklin Miktar Tayini 98
4.4.1.5.Lipozomlardaki Sodyum Taurokolat Miktar Tayini 98
4.4.1.6.Doksisiklinin Lipozom Formülasyonları İçindeki
Stabilitesine Ait Bulgular 98
4.5. Nanopartikül Formülasyonuna Ait Bulgular 101
4.5.1. Nanopartiküllerin Karakterizasyonuna Ait Bulgular 101
4.5.1.1. Nanopartiküllerin Partikül Büyüklüğü ve Dağılımına
Ait Bulgular 101
4.5.1.1.1.Doksisiklin Nanopartiküllerin Partikül Büyüklüğü ve
Dağılımına Ait Bulgular 101
4.5.1.1.2.Doksisiklin ve Sodyum Taurokolat Nanopartiküllerin
Partikül Büyüklüğü ve Dağılımına Ait Bulgular 103
4.5.1.2. Nanopartiküllerin Zeta Potansiyel Ölçümlerine Ait Bulgular 105
4.5.1.2.1.Doksisiklin Nanopartiküllerin Zeta potansiyel Ölçümlerine
Ait Bulgular 105
4.5.1.2.2.Doksisiklin ve Sodyum Taurokolat Nanopartiküllerinin
Zeta Potansiyel Ölçümlerine Ait Bulgular 106
4.5.1.3.Nanopartiküllerin Şekilleri 107
4.5.1.4.Nanopartiküllerin Hazırlanmasında Kullanılan
Karıştırma Hızı ve Polimer Miktarının Seçimi 108
4.5.1.5.Nanopartikülden Doksisiklin Miktar Tayini 109
4.5.1.6.Nanopartiküllerden Sodyum Taurokolat Miktar Tayini 109
4.5.1.7.Doksisiklinin Nanopartikül Formülasyonlarının İçindeki
Stabilitesine Ait Bulgular 109
4.6.Hücre Kültüründen Geçiş Çalışmalarına Ait Bulgular 112
4.6.1.Hücre İçermeyen Membran Geçişleri 112
4.6.2.Caco-2 Hücrelerinden Geçiş Çalışmalarına Ait Bulgular 113
4.6.2.1.Caco-2 Hücrelerinden Geçiş Çalışmalarında k Değerlerinin
Hesaplanması 116
4.6.2.2.Caco-2 Hücrelerinin Elektrik Dirençlerine Ait Bulgular 119
VII
4.6.3.Diyaliz Membrandan Geçiş Çalışmalarına Ait Bulgular 120
4.6.4.Caco-2 ve Diyaliz Membrandan Geçiş Çalışmalarının
Karşılaştırılması 125
4.7.MMP-2 Tayini Sonucu 128

5.TARTIŞMA 129
5.1.Analiz Yöntemlerinin Seçimi 129
5.1.1.Doksisiklin İçin Analiz Yönteminin Seçimi 129
5.1.2.Sodyum Taurokolat için Analiz Yönteminin Seçimi 129
5.2.MTT Yöntemine Ait Bulguların Değerlendirilmesi 130
5.3.Lipozom Formülasyonuna Ait Bulguların Değerlendirilmesi132
5.3.1.Lipozom Formülasyonuna Ait Karakterizasyon
Çalışmalarının Değerlendirilmesi 132
5.3.2.Lipozom Formülasyonuna Ait Zeta Potansiyeli Ölçümlerinin
Değerlendirilmesi 133
5.3.3.Lipozomlar İçinde Bulunan Doksisiklin Miktarının
Değerlendirilmesi 133
5.3.4. Lipozomlar İçinde Bulunan Sodyum Taurokolat
Miktarının Değerlendirilmesi 134
5.3.5.Doksisiklin Lipozom Formülasyonu İçindeki Stabilitesinin
Değerlendirilmesi 134
5.4. Nanopartikül Formülasyonuna Ait Bulguların
Değerlendirilmesi 136
5.4.1.Nanopartikül Formülasyonuna Ait Karakterizasyon
Çalışmalarının Değerlendirilmesi 136
5.4.2. Nanopartikül Formülasyonuna Ait Zeta Potansiyeli
Ölçümlerinin Değerlendirilmesi 136
5.4.3. Nanopartiküller İçinde Bulunan Doksisiklin Miktarının
Değerlendirilmesi 137
5.4.4. Nanopartiküller İçinde Bulunan Sodyum Taurokolat
Miktarının Değerlendirilmesi 137
VIII