Table Of ContentA. Cavazza - V. Tini - C. Zambonelli
11rREDA
edizioniper l'agl~ric~ol~tu~ra~ ~ _
A Cavalla V Tini C Zambonel i - - - - -
f------
\
•
1tREDA
edizioniperl'agricoltura
Direzione editoriale:
DomenicoUgulini
Progettografico, impaginazione e copertina:
CaterinaMarcucci
Ricerca iconograficae illustrazioni:
-A. Cavazza,V. Tini, C. Zambonelli
-Archivio IconograficoIstituto Agrario S. MicheleAll'Adige
-DottoressaLorenaCastellari (CATEVTebano -Faenza)
-Le fotografie al microscopio elettronico sono stateeseguiteda MarziaBenevelli
-CRPV (Centro Ricerche Produzioni Vegetali)
-TRACE Snc
Redazione:
Reda Edizioni -Gianni D'Arco
Caterina Marcucci
Realizzazionelastre CTP:
FotoincisaEFFEGI, Savigliano (CN)
Stampa:
Reda EdizioniTorino
Proprietà letterariae artistica riservata.
L'Editore, nell'ambito delle leggi internazionali sul copyright, è a disposizione degli aventi diritto non potuti
rintracciare.
1a edizione: gennaio 2006
Ristampa:
5 4 3 2 1
2010 2009 2008 2007 2006
© Reda Edizioni
ViaSansovino, 243/22/R- 10151 Torino
Telefono 01114513611 - fax 01114513612
internet: www.redaedizioni.it
E-mail: [email protected]
III •
Presentazione
La Microbiologia è scienza giovane, nata (guarda caso) come Microbiologia Enologica poco più di 150
anni fa con i primi studi sul vino eseguiti da Pasteur. Per moltissimo tempo nel mondo universitario la
Microbiologiaèstataconsideratamateriamarginaleepocoimportante, tanto chesololeFacoltàdiAgraria
la comprendevano nel loro piano di studi con l'insegnamento fondamentale di 'iMicrobiologiaAgraria e
Tecnicà' (Microbiologia del Terreno e MicrobiologiaTecnologica, collegata alle IndustrieAgrarie). Nelle
Facoltàdi Medicinaeraconsiderataunaappendicedel corso di Igiene esolamente negli anni '50 delseco
lo scorso ha assunto la propria dignità d'insegnamento fondamentale. Nelle Facoltà di Scienze l'insegna
mento della Microbiologia poteva essere complementare e veniva mutuato, appunto, dalle Facoltà di
Agraria.
Negli ultimi 30 anni la considerazione verso questa materia è radicalmente cambiata ed attualmente
occupa e svolge un ruolo di primissimo piano interessando, a 360 gradi, tutti i rami della biologia e
non solo. Molto intensa è stata l'attività di ricerca riguardante il settore alimentare verso il quale è
stata rivolta un'attenzione del tutto particolare, prendendone in esame vari aspetti come quello della
sicurezza igienico-sanitaria e quello della stabilità dei prodotti. Va infatti considerato che gli alimen
ti, dalle materie"'prime ai prodotti pronti per il consumo, sono potenziali vettori di batteri patogeni
o di tossine di origine microbica, oltre che di svariati microrganismi che ne possono compromettere
la commestibilità. I metodi per la ricerca di singole specie o di gruppi microbici sono stati messi a
punto e ben codificati per ogni singolo alimento e per ogni possibile situazione e hanno carattere di
ufficialità. Sull'argomento sono stati pubblicati numerose opere e prontuari in grado di rispondere a
qualunque domanda degli analisti.
Il settore della Microbiologia Enologica, dal punto di vista analitico, non è altrettanto esauriente, forse
perché il vino, perlasuacomposizione, non può esserevettore di batteri patogeni o tossigeni e non pre
senta alcun problema sotto l'aspetto igienico-sanitario: la peggior cosa che può accadere a un vino è
quella di diventare aceto, magari un buon aceto. Tuttavia spesso si richiede, agli enologi e ai
produttori/trasformatori vitivinicoli, anche di presentare una certificazione microbiologica (che riguar
da prevalentemente la stabilità dei prodotti) come di eseguire dettagliate analisi di laboratorio per le
quali manca una metodologia consolidata.
[organismo internazionale al quale èaffidato il compito di regolamentare tutto il settore dellavite edel
vino èl'OIV (Organisation InternationaLde La Vigne etdu Vin) con sede a Parigi ea cui aderiscono, con
parità di voto, tutti gli stati nazionali interessati alla produzione del vino con l'obbligo di introdurre
nella propria legislazione tutto ciò che viene deciso. Ovviamente l'OIV si occupa anche della parte
microbiologica, maquanto hafinora stabilito in materia analiticasi limitaa pochissimi argomenti, non
certo in grado di rispondere alle attuali domande degli enologi.
III
______ 11
Il motivo che ci ha indotto a preparare la presente Opera è proprio questa pressante richiesta degli
addetti al settore, di un "prontuario" (compatto, immediato e di facile lettura) che li metta in condi
zione di eseguire, secondo standard consolidati, le analisi microbiologiche di varia natura. In man
canza di metodologie "ufficiali" si è deciso di privilegiare e sviluppare quei procedimenti proposti o
adottati dai vari Autori che, nel corso del tempo, hanno indagato ed eseguito studi sperimentali nel
settore microbiologico applicato alle trasformazioni enologiche.
L:augurio, così come l'obiettivo che ci siamo dati insieme all'Editore, è che questa "Microbiologia
Enologica in Laboratorio" possa facilitare il lavoro dei professionisti che operano nella splendida realtà
enologica italiana e possa contribuire positivamente alla preparazione professionale degli studenti che
frequentano i corsi di enologia.
Per me, personalmente, è risultato molto gradevole e facile lavorare con persone competenti e corrette
quali sono i più giovani colleghi Cavazza eTini ai quali va attribuito quanto di meglio si può trovare in
quest'Opera. È poi motivo di grande soddisfazione che la Casa Editrice "Redà' abbia accolto con favore
la nostrarichiestadi pubblicazionedelvolume: fin daquando ero studente, neglianni '40 delsecoloscor
so (talvolta mi sembra impossibile che sia passato tanto tempo...) settimanalmente mi recavo presso la
libreriaGalleri, inviaIndipendenzaaBologna, che in unavetrinettaesternaesponevatuttile novitàlibra
rie edite dalla Reda. Inquellecircostanze, ho piùvolte immaginato esognato che fra quei libri cenefosse
anche uno col mio nome. Poi le cose sono andate come sono andate sia per la Reda di.quei tempi che
per la libreria Galleri (che ha chiuso). Ora che vedo anche soddisfatto quel mio sogno'giovanile, sono
grato alla nuova Reda e spero che questo volume contribuisca alla sua fortuna editoriale.
Carlo Zambonelli
IV
I Il I
Indice
PARTE PRIMA GENERALE 03_1 mezzi nutritivi 23
3.1Junzioni eclassificazioni 23
A
I microrganismi: 3.2_1 preparati del commercio 24
determinazione e controllo 1 3.3_Mezzi eterreni per lieviti 25
Mezzodi Sabouraud 25
-
01_1 microrganismi degli alimenti 2 MezzoYPG
-
1.1_Generalità 2 (YeastExtract, Peptone, Glucose) 26
1.2_1 microrganismi del vino 4 _Malto (YM) 26
l.3_le analisi microbiologiche _WL NutrientMedium (WL NutrientAgar) 26
_Agar-lisina 27
degli alimenti 5
_Agar-acetato 27
Il caso del vino 6
-
Mezzo sintetico 28
Imetodi di analisi 6 -
-
_Gorodkowa-agar 29
02_1 laboratori di microbiologia 9 _Terreno BiGGY 29
_Antibiotici 30
2.1 Il laboratorio. Caratteristiche
3.4_1 terreni per batteri lattici 30
efunzioni 9
_TerrenoATB 31
2.2_Gli ambienti egli arredi fissi 11
_Terreno per Leuconostocoenos
2.3_Gli attrezzi 12
(Oenococcusoem) 31
-'I microscopio ottico 12
_Terreno diWeillereRadler 31
Itermostati 13
-
_Terreno SL 32
-'I frigorifero 14
_Terreno MRS 32
-'I congelatore 14
3.5_Mezzi eterreni per batteri acetici 32
Il forno amicroonde 14
- _Terreno all'etanolo 33
_Lapparatofiltrante 14
_Terreno GYC 33
_La centrifuga 15
_Terreno al mannitolo (MYP) 34
La cucina 16
- _Terreno di Lafon-Lafourcade eJoyeux 34
Lautoclave 16
- 3.6_Terreni per enterobatteri 34
2.4_Altre attrezzature 18
_Violet Red BileAgar(VRBA) 35
_La cappa aflusso laminare 18 _Le.
Broth (per Escherichia coli) 35
_II microscopio aepifluorescenza 20 _MacConkey Sorbitol agar
-'I microscopio stereoscopico 21 (perenterobatteri) 35
_Gli agitatori 22 3.7_Terreni per microrganismi generici 36
_La vetreria egli attrezzi minori 22 _Plate CountAgar 36
-'I materiale "usa egetta" 22 3.8_Mezzi di arricchimento 36
V
... 11
3.9_1 diluenti 36 4.3_la filtrazione 39
_Soluzionefisiologica 37 4.4_la sterilizzazione chimica 40
_Acqua peptonata 37
4.5_le radiazioni ionizzanti 40
4.6_1 raggi ultravioletti 41
04_la sterilizzazione 38
4.1_Definizione 38 4.7_le alte pressioni meccaniche 41
4.2_la sterilizzazione acaldo 38 4.8_la pasteurizzazione 41
PARTE SECONDA SPECIALE
B
Criteri e metodi
3.5_Determinazione del carico microbico 60
di microbiologia analitica 43
Premessa 60
01 le colture microbiche 44 04_11 campionamento 61
1.1_lostato delle cellule 44 4.1_Definizione eprocedura 61
_La moltiplicazionedelle cellule 44
_Prelievo dei campioni 61
1.2_lacoltura pura microbica 45
_Piani di campionamento 63
_Ottenimento dellecolture pure 45
_Trasporto econservazione dei campioni 63
1.3_Esamedelle colonie 47
4.2_Preparazione del campione 64
_Esame microscopicofresco 47
_Diluizione dei campioni 64
1.4_Trasferimento delle colonie 49
4.3_Conteggio diretto 66
1.5_1 ceppi microbici 50
_" contaglobuli BLirker 66
Le collezioni 51
_" contaglobuli diThoma 67
Il mantenimento delle collezioni 52
4.4_Conteggio indiretto 69
02_lo sviluppo nei mezzi liquidi 53 _La centrifugazione 71
La filtrazione 71
2.1Jasi dello sviluppo 53
2.2_l'accumulo dei prodotti 4.5_Concentrazione del campione 71
di fermentazione 54
Applicazioni 72
2.3_Curve di sviluppo 54
CAnalisi microbiologica dell'aria 72
03 Il carico microbico 57 2_Analisi microbiologiche
disuperfici 73
3.1_Definizioni 57
3.2_le unità facenti colonia (ufc) 58 3_1/sistema HACCP
3.3_Significato del carico microbico 58 Approfondimento -Shelf-/ife 74
3.4_11 caso del vino 59 4_La colimetria 74
VI
I I I I
3.1_1 microrganismi dell'uva 94
PARTE TERZA ApPLICATlVA
C
Analisi di microbiologia
enologica 77
3.2_la contaminazione casuale 94
3.3_Analisi dell'uva sana 94
01 Caratterizzazione ed identificazione 3.4_Analisi di singoli acini 95
-
dei lieviti 78 3.5_Analisi di grappoli 96
1.1_Generalità 78 3.G_Analisi della carposfera 96
1.2_ldentificazionedelle specie 3.7_Analisi dell'uva danneggiata 97
più importanti 80
_Riconoscimento di Saccharomycescerevisiae 80 04_Analisi microbiologiche dei mosti
_Riconoscimento dei Saccharomyces e delle fecce 99
4.1_Controllo del mosto 99
freddo-fermentanti 81
4.2_Controllo del mosto non ancora
_Riconoscimento dei lieviti apiculati
(Kloeckera apiculataed altrespecie) 81 in fermentazione 100
_Riconoscimento di Saccharomycodesludwigii 82
Applicazioni 101
Riconoscimentodi Metschnikowia
CMetodimicroscopici 101
pulcherrima 82
2_Conta su piastra 101
_Riconoscimento di Schizosaccharomyces
3_Ricerca di lieviti ebatteriacetici 101
pombe 83
4_Ricerca di batteri lattici 102
Riconoscimento di Pichiamembranifaciens 83
-
4.3 Determinazione della carica
_Riconoscimento di Torulaspora delbrueckii
batterica totale edei mosti 102
eZygosaccharomycesspp. 84
4.4_Analisi microbiologiche delle fecce 102
_Riconoscimento dei lieviti dei generi Dekkera
eBrettanomyces 85
OS_Analisi microbiologiche del vino
Riconoscimento di Pichiaanomala 86
in bottiglia 104
Riconoscimento di altri lieviti 86
5.1_" metodo standard 104
5.2_Vino filtrato opasteurizzato in bottiglia 105
02 Caratterizzazione delle colture 87
_Conteggio dei lieviti 105
2.1_Caratteristiche enologiche 87
_Campionamento 105
_Determinazione dellacapacitàfermentativa 87
_Conteggio dei batteri lattici 107
_Determinazione dei caratteri di competitività 88
Determinazionedell'alcol-tolleranza 90
06_Le analisi microbiologiche dei
_Detrminazionedellacapacità diflocculazione 90
coadiuvanti enologici 108
_Determinazione dellacapacità schiumogena 90
G.1_Analisi microbiologiche del lievito
_Determinazionedellatemperatura ottimale 91
disidratato (l5A) 108
_Determinazione della capacità fermentativa
_Conteggio dei lieviti 108
abassetemperature 91
_Conteggio dei batteri 109
_Formazione di composti secondari
G.2_Analisi microbiologica del Mosto
della fermentazione 92
Concentrato Rettificato (MCR) 110
_Produzione di composti solforati 92
J ceppi di riferimento 93 Approfondimento 1-Espressione deirisultati
deiconteggidimicrorganismi 111
03_Analisi microbiologica dell'uva 94 Approfondimento 2 -Incertezza dimisura 112
VII
..- - 11
Gli Autori
Agostino Cavazza
Nato a Bologna nel 1959, si è laureato in ScienzeAgrarie nel 1983. Dal 1986 è responsabile dellabo
ratorio di microbiologiadell'IstitutoAgrario di S. MicheleAll'Adige. Hapubblicato diversi lavoriscien
tifici sul metabolismo dei lieviti enologici esui metodi di controllo della qualità in enologia. Dal 1994
è in possesso del titolo di Enologo e nel 1995 ha superato l'esame come valutatore di sistemi qualità.
Dal 1997 al 2000 è stato docente incaricato di Microbiologia Generale e di Microbiologia Enologica
presso la sede italiana della Fachhochschule "Diplom-Ingenieur (FH) Weinbau und Oenologie"; dal
2001 è docente incaricato presso l'Università di Trento.
Dal 2004 fa parte del comitato tecnico di coordinamento OIVitaliano, è esperto tecnico dellacommis
sione di microbiologia dell'OIV ed è a capo del gruppo di lavoro incaricato dall'OIV di aggiornare i
metodi di analisi microbiologica di mosti e vini.
Vincenzo Tini
Nato a Brisighella (RA) nel 1944, si è laureato in ScienzeAgrarie a Bologna e dal 1976 è responsabile
del Centro Lieviti di Tebano (Faenza).
Dal 1988 al 1991 è stato docente di Microbiologia Agraria e Tecnica presso l'Università di Reggio
Calabria. Dal 1991 a tute'oggi è titolare dei corsi di MicrobiologiaApplicata alle ProduzioniAnimali e
di Tecniche Microbiologiche nei rispettivi corsi di laurea di Produzioni Animali e di Viticoltura ed
Enologia dell'Università degli Studi di Bologna.
Carlo Zambonelli
È nato a Bologna nel 1926 dove si è laureato in ScienzeAgrarie nell'a.a. 1948/49. Ha svolto tutta la sua
intensa attività di ricerca e didattica nel settore della Microbiologia agraria. Èautore di numerosi scritti e
articoli scientifici sui lieviti del vino ed altri alimenti fermentati, pubblicati su riviste nazionali e interna
zionali. È autore di diversi volumi riguardanti la microbiologia del vino.
Dal 2001, dopo aver raggiunto i limiti di età per l'attività accademica, ha continuato ad operare nel
settore collaborando con numerose istituzioni italiane e straniere (Sud Africa, Giappone, Nuova
Zelanda).
VIII
I I I I
Introduzione
Spesso, nello sviluppare i contenuti della Microbiologia Enologica, che si collocano nei corsi di indi
rizzo degli Istituti Tecnici Superiori ed ancor più nelle Università, vengono approfonditi gli aspetti
biochimici, metabolici, tassonomici ed ecologici dei lieviti e dei batteri che interessano il settore eno
logico. Tante di queste informazioni sono importanti perché vanno a costituire e consolidare quel
bagaglio teorico che permette al tecnico (enologo) di avere lapienapadronanzadelsuo operare in can
tina e di giustificare le proprie scelte operative nella produzione di vini di qualità. Inoltre, è risaputo
che la valorizzazione delle peculiarità enologiche di alcuni vitigni può realizzarsi anche attraverso la
conoscenza del metabolismo e dell'attività dei lieviti e dei batteri.
Tutte questeinformazioni non sono però di persésufficienti agarantire un elevato standardproduttivo in
termini qualitativi: la sicutezza di ottenere e mantenere una qualità costante eduratura nel tempo si può
garantire solo attraverso un attento controllo di tutte le fasi di produzione, ed in tal senso il controllo
microbiologico dei fattori edei processi non può e non deve essere trascurato.
Il consumatore che sceglie di acquistare un determinato vino in bottiglia, così come quando sceglie un
qualsiasi altro prodotto alimentare magari in funzione anche delle "armonie culturali" ad esso associate, si
aspetta non solo di trovarvi alcune caratteristiche legate afattori chimico-fisici esensoriali, cioè che "quel
vino scelto" sia ~iconoscibile esoddisfi appieno le sue aspettative, masi aspettache le qualità ad esso asso
ciatesiano presenti in tuttele bottiglieche acquista, anche in tempi eoccasioni diverse. In altre parole, un
vinodeveesseresempreimpeccabilequandovieneconsumato, indipendentementedal momentoedall'oc
casione. In questo senso, non èsufficiente che una buona materia prima (l'uva) sia trasformata secondo i
migliori standard tecnologici, se ciò non avviene sotto un attento e rigoroso controllo dei processi e dei
materiali impiegati, il tutto garantito anche dal punto di vista del controllo microbiologico.
La globalizzazione dei mercati è un fenomeno di cui si parla molto: anche il mercato del vino èsempre
più internazionale, sia con nuovi paesi produttori sia con nuovi paesi propensi al consumo, e la ricerca
di nuovi mercatifa sì chele bottiglieprodotte nel luogo d'originevengano poi commercializzate inpaesi
talvolta lontanissimi. In questo caso la comparsa di eventuali difetti nel vino diventa ancora più grave,
perché se da un lato comporta costi proibitivi per richiamare o sostituire il prodotto da mercati molto
lontani, dall'altro, in un contesto di fortissima concorrenza è un evento disastroso che nella maggior
parte dei casi non lascia unaseconda chance al produttore epuò mettere in crisi in quel contesto anche
il tipo di vino promosso. I..:introduzione sul mercato di vini che possano manifestare anche lievi difetti
è pertanto un rischio non più trascurabile e non facilmente rimediabile.
Da quanto sopra deriva che la Microbiologia Enologica non può più permettersi di restare circoscritta
nelle aule universitarie o scolastiche o nei laboratori di ricerca, ma deve entrare nelle cantine. Eseguire
controlli microbiologici, oggi, non significanecessariamente dedicarsi ad attivitàlaborioseche richiedo
no lunghi periodi di formazione e costosi materiali, ma (salvo i casi più particolari) eseguire analisi e
IX
