Karima AIT AISSA Etude de l'implication des cellules musculaires lisses vasculaires dans la ...

220 Pages·2013·2.88 MB·French

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Ecole Doctorale BioSE (Biologie-Santé-Environnement)

Thèse

Présentée et soutenue publiquement pour l’obtention du titre de

DOCTEUR DE l’UNIVERSITE DE LORRAINE
Mention : « Sciences de la Vie et de la Santé »

par
Karima AIT AISSA

Etude de l’implication des cellules musculaires lisses
vasculaires dans la distensibilité et le phénotype
thrombotique dans des modèles murins

Date de soutenance : 7 décembre

Membres du jury :

Rapporteurs :
Pr Philippe NGUYEN « PUPH, EA 3801, Reims »
Dr Mary OSBORNE « Chargé de recherche, Inserm U698 Paris »

Examinateurs:
Pr Denis WAHL « PUPH, UMR-S 961, Nancy»
Dr Zhenlin Li « Directeur de recherche, UMPC, Paris »
Dr Véronique REGNAULT « Chargé de recherche, UMR_S 961, Nancy »
Dr Patrick LACOLLEY « Directeur de recherche UMR_S 961, Nancy »

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UMR_S 961 Risque cardiovasculaire, rigidité fibrose et hypercoagulabilité

Remerciements

Je tiens à remercier le Dr Véronique REGNAULT, pour avoir encadré mon travail de thèse,
son aide scientifique et humaine qu’elle m’a apportée durant ces 3 années. Je la remercie
particulièrement pour tous ses conseils, sa disponibilité et pour tout ce qu’elle m’a appris.
Je tiens à remercier également, mon co-encadrant de thèse, le Dr Patrick LACOLLEY qui
m’a fait l’honneur de m’accueillir et m’a permis de réaliser ces travaux dans son laboratoire.
Je lui suis très reconnaissante pour sa confiance, ses remarques et son soutien scientifique.
Je tiens à remercier le Dr Mary OSBORNE, pour avoir accepté de juger ce travail de thèse
en qualité de rapporteur. Qu’elle trouve ici le témoignage de ma sincère gratitude et de
l’expression de mes remerciements.
Je tiens à remercier le Pr Phillipe NGUYEN, pour avoir également accepté de juger ce travail
de thèse en qualité de rapporteur. Qu’il trouve ici l’assurance de ma sincère reconnaissance et
de mon profond respect.
Je tiens à remercier le Pr Denis WAHL, pour avoir fait l’honneur de participer à ce jury en
tant qu’examinateur. Je le remercie sincèrement pour ses conseils pour ce travail.
Je tiens à remercier le Dr Zhenlin LI d’avoir fait l’honneur de participer au jury et accepté
d’examiner ce travail de thèse.
Je tiens à remercier très sincèrement le Dr Jean-Pierre MAX pour son implication et son
soutien technique dans ces travaux. Je voudrais saluer le soutien, l’engagement et la
disponibilité dont il a fait preuve tout au long de mon doctorat et qui m’ont permis d’avancer
dans mes travaux de recherche.
Je tiens à remercier le Dr Huguette LOUIS, pour toute son aide scientifique et expérimentale
pour la réalisation de mon projet de thèse. Je tiens tout particulièrement à lui exprimer toute
ma reconnaissance pour sa patience et sa présence dans des moments très difficiles et
stressants.
Je tiens à remercier le Dr Simon N THORNTON pour toutes les corrections en anglais et
ses conseils scientifiques dans cette thèse.
Remerciements

Je tiens à remercier mon collègue de bureau et de travail, Jérémy LAGRANGE, pour son
aide, son soutien et sa patience. Je tiens également à lui exprimer toute ma reconnaissance
pour sa bonne humeur et son esprit positif dans les moments où le moral n’y était.
Je tiens à remercier Gina, Anna, Z’hor, Anne, Natalia, Audrey, Laurent, Elodie, Natalie,
et tous les membres du laboratoire d’Inserm U961 pour leurs soutiens, leurs bonnes humeurs
et leurs conseils durant ces années de thèse.
Je tiens à remercier tout particulièrement ma mère, mes frères, mon grand père et surtout mes
oncles qui m’ont beaucoup soutenu et aidé durant ces 3 années comme dans toutes mes
démarches, ma venue en France, mes études, mes ambitions... Cette thèse est un peu la votre,
elle représente pour moi la reconnaissance de votre éducation car c’est grâce à vous si j’en
suis là. C’est dans ces moments que celui là que je regrette le plus l’absence de mon père à
qui je dois entièrement l’accomplissement de cette étape de ma vie.
Je remercie également tous mes amis, Farid, Samia, Zohra, Nawal, Fahima, Dihia,
Boubekeur, Katia, Hacène, Cathrine, Arnaud … et beaucoup d’autres qui m’ont soutenu
durant ces 3 années de thèse.
Sommaire

Sommaire

Sommaire ---------------------------------------------------------------------------------------------------- 1
Liste des abréviations-------------------------------------------------------------------------------------- 6
Contexte ------------------------------------------------------------------------------------------------------ 10
Etude bibliographique ------------------------------------------------------------------------------------ 12
I. Le vaisseau- paroi artérielle --------------------------------------------------------------------------- 12
I.1.1 Intima- Endothélium -------------------------------------------------------------------------------- 12
I.1.1.1. Activité antithrombotique ---------------------------------------------------------------------- 13
a. Inhibition de l’adhésion-agrégation plaquettaire ------------------------------------------------ 14
b. Inhibition de la coagulation --------------------------------------------------------------------------- 14
c. Action fibrinolytique ------------------------------------------------------------------------------------ 15
I.1.2. Activité prothrombotique ------------------------------------------------------------------------- 15
I.1.3. Contrôle du tonus vasculaire --------------------------------------------------------------------- 15
I.2 Média ----------------------------------------------------------------------------------------------------- 18
I.2.1. Les cellules musculaires lisses vasculaires ----------------------------------------------------- 18
I.2.2. Rôle des facteurs mécaniques sur la différenciation des CML ---------------------------- 19
I.2.3. Marqueurs majeurs de différenciation dans les CML -------------------------------------- 21
I.3 Adventice ------------------------------------------------------------------------------------------------ 22
II. Hémostase ------------------------------------------------------------------------------------------------ 22
II.1. Hémostase primaire --------------------------------------------------------------------------------- 23
a. Temps vasculaire ---------------------------------------------------------------------------------------- 23
b. L'adhésion plaquettaire-------------------------------------------------------------------------------- 23
c. L'activation plaquettaire------------------------------------------------------------------------------- 24
II.2 Les protéines de la coagulation -------------------------------------------------------------------- 26
II.2.1 Les facteurs de la coagulation -------------------------------------------------------------------- 26
II.2.2 Eléments cellulaires ------------------------------------------------------------------------------- 29
II.2.3. Les inhibiteurs de la coagulation --------------------------------------------------------------- 30
II.3. Hémostase secondaire ------------------------------------------------------------------------------ 31
II.3.1. Initiation --------------------------------------------------------------------------------------------- 32
II.3.2. Amplification et propagation du système ----------------------------------------------------- 33
II.4. Régulation --------------------------------------------------------------------------------------------- 34
II.5. Lieu de synthèse des différents facteurs --------------------------------------------------------- 34
II.6. L’hémostase chez le rat ----------------------------------------------------------------------------- 35
III. Pathologies liées au vaisseau- vieillissement artériel------------------------------------------- 37
III.1 La rigidité artérielle --------------------------------------------------------------------------------- 38
1
Sommaire

III.2. La coagulation dans l’hypertension ------------------------------------------------------------- 40
III.3. Implication des CML dans la cascade de coagulation -------------------------------------- 41
III.4. Effets cellulaires de la thrombine sur le remodelage vasculaire -------------------------- 42
III.5. La dysfonction endothéliale ----------------------------------------------------------------------- 46
III.6. La réactivité vasculaire ---------------------------------------------------------------------------- 47
IV. Les modèles animaux --------------------------------------------------------------------------------- 49
IV.1. Modèle d’hypertension ----------------------------------------------------------------------------- 49
IV.1.1. Un modèle de rat spontanément hypertendu ----------------------------------------------- 49
IV.1.2. Rat spontanément hypertendu stroke prone ------------------------------------------------ 50
IV.1.3. Rat Dahl sensible au sel -------------------------------------------------------------------------- 50
IV.1.4. Modèles transgéniques d’hypertension ------------------------------------------------------ 51
IV.1.5. Rat hypertendu Borderline --------------------------------------------------------------------- 51
IV.2. Modèle de caractérisation de la différenciation du muscle lisse -------------------------- 52
Objectifs ------------------------------------------------------------------------------------------------------ 54
Matériels et méthodes ------------------------------------------------------------------------------------ 56
I. Animaux --------------------------------------------------------------------------------------------------- 57
II. Prélèvement de sang et d’organes------------------------------------------------------------------- 57
III. Isolement des cellules endothéliales et des cellules musculaires lisses aortiques de rat 57
III.1. Culture cellulaire------------------------------------------------------------------------------------ 58
III.1.1. Milieux de culture -------------------------------------------------------------------------------- 58
III.1.2. Croissance cellulaire ----------------------------------------------------------------------------- 59
III.2. Immunocytochimie --------------------------------------------------------------------------------- 59
IV. Mesure de la génération de thrombine (Thrombinographie) -------------------------------- 59
IV.1. Définition générale de la technique-------------------------------------------------------------- 59
IV.2. Préparation des spécimens plasmatiques (PRP-PPP-Pool de PPP) ---------------------- 60
IV.3. Conditions de la réalisation du test -------------------------------------------------------------- 61
IV.3.1. Les paramètres thrombinographiques ------------------------------------------------------- 61
IV.1.2 Mesure de la génération de thrombine au niveau du plasma riche et pauvre en
plaquettes ---------------------------------------------------------------------------------------------------- 63
IV.1.3. Mesure de la génération de thrombine à la surface de la paroi aortique, des CML
et CE ---------------------------------------------------------------------------------------------------------- 64
IV.1.3.1. Anneaux aortiques de rat --------------------------------------------------------------------- 64
IV.1.3.2. CML et CE --------------------------------------------------------------------------------------- 64
V. Mesure des facteurs pro- et anticoagulants ------------------------------------------------------- 66
2
Sommaire

V.1 Mesure de l’activité procoagulante des phospholipides (PPA) ------------------------------ 66
V.2. Mesure de l’activité du facteur tissulaire ------------------------------------------------------- 67
V.3. Mesure de l’activité de TFPI ----------------------------------------------------------------------- 68
V.4. Dosage de la prothrombine (facteur II) --------------------------------------------------------- 69
V.5. Dosage du fibrinogène (facteur I) ----------------------------------------------------------------- 69
V.6. Dosages des complexes Thrombine/Anti-thrombine (TAT) --------------------------------- 69
V.7. Dosage de l’antithrombine ------------------------------------------------------------------------- 70
VI. Quantification de l’expression génique par PCR en temps réel (PCRq) ------------------ 70
VI.1 Extraction des ARN --------------------------------------------------------------------------------- 70
VI.2. Transcription reverse (RT) ----------------------------------------------------------------------- 71
VI.3. Réaction de PCR quantitative en temps réel (PCRq) --------------------------------------- 71
VII. La fonction vasculaire chez l’animal ----------------------------------------------------------- 72
VII.1. Réactivité vasculaire sur carotide et mésentère de souris --------------------------------- 72
VII.2. Réactivité vasculaire sur carotide de rat ------------------------------------------------------ 72
Résultats ------------------------------------------------------------------------------------------------------ 74
I. Analyse hématologique --------------------------------------------------------------------------------- 75
II. Etude de la coagulation in vitro ---------------------------------------------------------------------- 76
II.1. La coagulation au niveau du plasma ------------------------------------------------------------- 76
II.1.1. Génération de thrombine dans le plasma ----------------------------------------------------- 76
II.1.2. Quantification des facteurs de coagulation dans le plasma ------------------------------- 81
II.1.3. Effet du FT sur le taux de thrombine générée dans du plasma -------------------------- 83
II.1.4. Effet de la prothrombine et du TFPI sur l’ETP in vitro ----------------------------------- 84
II.2.5. Expression hépatique des facteurs de coagulation FII et FV chez le rat SHR -------- 85
II.2. La coagulation au niveau pariétal --------------------------------------------------------------- 86
II.2.1. Génération de thrombine à la surface d’anneaux artériels ------------------------------- 87
II.2.2. Génération de thrombine à la surface d’anneaux aortiques ------------------------------ 89
II.2.3. Génération de thrombine à la surface des CE et des CML vasculaires ---------------- 91
II.2.3.1. Effet du détachement des cellules par la trypsine sur l’activité procoagulante ---- 91
II.2.3.2. Effet de la concentration en FT sur la génération de thrombine à la surface des
CML ----------------------------------------------------------------------------------------------------------- 92
II.2.3.3. Effet de la PCa et du TFPI sur les paramètres thrombinographiques des CML -- 93
II.2.4. Dosage des facteurs hémostatiques pariétaux ----------------------------------------------- 94
III. Interaction coagulation et remodelage vasculaire ---------------------------------------------- 95
III.1. Expression des récepteurs de la thrombine par les CML vasculaires ------------------- 96
3