Grupo Científico Latino-Americano de Trabajo Sobre Identificación Humana RESÚMENES

17 Pages·2016·0.52 MB·Spanish

by  Leonor Gusmão

GCLATIH - Grupo Científico Latino-Americano de Trabajo Sobre Identificación Humana

RESÚMENES/RESUMOS

POWERPLEX FUSION 6C: ESTUDIOS DE VALIDACIÓN. APLICACIÓN EN LA
RESOLUCIÓN DE CASOS FORENSES
PABLO MARTÍN MARTÍN
INSTITUTO NACIONAL DE TOXICOLOGÍA Y CIENCIAS FORENSES DE MADRID

Se comenzará con una pequeña introducción del Kit PowerPlex Fusion 6C.
En cuanto a los estudios de validación, en la charla se presentará un resumen de los
resultados de validación del kit Fusion 6C, se repasarán los parámetros de validación
estudiados en este centro, haciendo especial hincapié en los experimentos
realizados para establecer el umbral analítico, así como los estudios de sensibilidad
para establecer el umbral estocástico, se comentarán los experimentos de mezclas
con el objetivo de comprobar la sensibilidad del componente minoritario.
Como transición a la segunda parte de la charla se comentarán los métodos de
análisis empleados en nuestro laboratorio: extracción, cuantificación, detección y
análisis de datos.
Por último, en cuanto a la aplicación del kit en la casuística, se expondrá el
comportamiento del kit en la amplificación de muestras que presentan inhibición, en
muestras degradadas y en muestras con baja cantidad de ADN. Se mostrarán
algunos ejemplos de casuística forense con distintos fluidos (saliva, semen, restos
óseos) o soportes (ropas, tomas corporales, etc) en los que se valorarán aspectos de
interés forense como mezclas complejas, mezclas con contribuciones minoritarias,
muestras antiguas y deterioro de restos biológicos.
Por último, se recomendará el de uso un segundo kit complementario en caso de
que aparezcan productos inespecíficos, artefactos u otro tipo de resultados no
esperados.

1
GCLATIH - Grupo Científico Latino-Americano de Trabajo Sobre Identificación Humana

TIPAGEM DE DNA A PARTIR DE IMPRESSÕES DIGITAIS PARA EMPREGO EM
PERÍCIA CRIMINAL NO ÂMBITO DA JUSTIÇA MILITAR BRASILEIRA
OLIVEIRA, THAÍS PATRÍCIO1; SILVA, DAYSE APARECIDA2; CARVALHO, ELIZEU
FAGUNDES2
1INSTITUTO DE BIOLOGIA DO EXÉRCITO (IBEX), MINISTÉRIO DA DEFESA, BRASIL.
2LABORATÓRIO DE DIAGNÓSTICOS POR DNA, IBRAG, UNIVERSIDADE DO ESTADO DO RIO DE
JANEIRO, RIO DE JANEIRO, BRASIL.

No âmbito da genética forense, o programa denominado de “Estudos
Estratégicos em Defesa Nacional, em Educação e Ensino Militar” tem como metas
principais a padronização e validação de metodologias para a análise forense de
DNA a partir de vestígios biológicos recolhidos de impressões digitais. Os estudos vêm
sendo realizados, há dois anos, a partir da parceria estabelecida entre o Instituto de
Biologia do Exército e o Laboratório de Diagnósticos por DNA da Universidade do
Estado do Rio de Janeiro. Além de contribuir para o aprimoramento técnico e
científico da Subdivisão de Genética e Repositório de Amostras do Exército Brasileiro,
a iniciativa tem possibilitado a formação de novos profissionais para atuação em
genética forense, bem como a melhoria da capacitação de recursos humanos
especializados, no âmbito das aplicações forenses do DNA, área estratégica do
Ministério da Defesa.
Impressões papilares latentes têm sido comumente usadas por especialistas
forenses do Exército Brasileiro como uma ferramenta eficaz para a identificação
humana em investigações criminais. Nos casos em que as impressões digitais são
consideradas inadequadas para a identificação individual através de datiloscopia,
a tipagem de regiões polimórficas do DNA de vestígios biológicos recolhidos das
impressões digitais se constitui como uma metodologia alternativa para a
continuidade da análise de evidência recolhida em local de crime. Nesse contexto,
estudos relacionados com diferentes metodologias de coleta e extração de DNA de
vestígios biológicos presentes em impressões digitais observadas em suportes de vidro
e de metal encontram-se em andamento. Para isto, através de suabes, foram
coletados vestígios de impressões digitais deixadas por voluntários militares em
2
GCLATIH - Grupo Científico Latino-Americano de Trabajo Sobre Identificación Humana
superfícies de vidro ou metal, com a utilização de duas soluções: NaCl a 0,9% ou SDS
a 2%. O DNA foi isolado por duas distintas metodologias: Solução de Lise (SDS a 0,05%
e 20 mg/ml de proteinase K) + fenol-clorofórmio ou Kit QIAmp® Investigator® DNA
(Qiagen). A amplificação por PCR de regiões STR do DNA foi realizada com o
multiplex AmpFLSTR® MiniFiler ™ PCR Kit (Life Technologies). Os produtos de
amplificação foram submetidos à eletroforese no equipamento ABI PRISM® 3500
Genetic Analyzer (Applied Biosystems) e os dados analisados com o Software ID
GeneMapper® v1.2 (Applied Biosystems). As duas soluções de coleta de vestígios
biológicos bem como as preparações de DNA obtidas pelas duas metodologias de
extração de DNA se correlacionaram com eficientes tipagens de loci STR dos
vestígios biológicos recolhidos de impressões digitais obtidas em suportes de vidro ou
de metal, possibilitando a obtenção de perfis genéticos inquestionáveis.

Palavras-chave: DNA, Forense, Impressões Digitais, Exército Brasileiro

DIVERSIDADE DE TIPOS DE MARCADORES: UMA CHAVE PARA SOLUCIONAR
CASOS COM AMOSTRAS DE DNA DEGRADADO
POLVERARI, FERNANDA SILVA1,2; AMBROSIO, ISABELA BRUNELLI1,2; BRAGANHOLI,
DANILO FAUSTINO1; MARTINEZ, JULIANA1; CICARELLI, REGINA MARIA BARRETTO1
1LABORATÓRIO DE INVESTIGAÇÃO DE PATERNIDADE – NAC, FACULDADE DE CIÊNCIAS
FARMACÊUTICAS, 2INSTITUTO DE QUÍMICA, UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA, ARARAQUARA,
SP, BRASIL.

Na rotina de análises forense e de parentesco pode existir uma diversidade de tipos
de casos sendo necessária a combinação de diferentes métodos de análise para
obtenção de um resultado conclusivo, especialmente com amostras de DNA
degradado. Aqui nós apresentamos dois casos de análise de parentesco com DNA
degradado, onde além de STRs autossômicos foi também necessária a análise de
marcadores sexuais e sequenciamento do mtDNA. O primeiro caso foi uma
investigação de paternidade com amostra de sangue proveniente da suposta mãe
e uma amostra de osso exumada de um recém nascido do sexo masculino que
3
GCLATIH - Grupo Científico Latino-Americano de Trabajo Sobre Identificación Humana
morreu logo após o nascimento. Talvez devido à fragilidade do osso e das condições
do enterramento, a análise de marcadores autossômicos não gerou um resultado
conclusivo, sendo necessária a análise do mtDNA que indicou uma exclusão de
maternidade. O segundo caso é uma investigação de paternidade com amostras
de sangue de dois irmãos (um homem e uma mulher), da mãe biológica e amostra
de osso do suposto pai. A análise de STRs e INDELs autossômicos indicaram a inclusão
de paternidade para a filha mulher, mas houve exclusão de paternidade para o filho
homem. Esta exclusão de paternidade foi confirmada pela análise de Y-STRs. Ambos
os casos, usando STRs e INDELs autossômicos, Y-STRs e/ou mt DNA mostram a
importância da combinação de marcadores para obtenção de resultados robustos,
especialmente quando o DNA esta degradado.

Palavras-chave: A-STRs; INDELs; mtDNA; Y-STRs; Teste de paternidade; Ossos.

Financiamento: Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
(CAPES); Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq).

IDENTIFICACIÓN DE UNA VÍCTIMA DE UN CASO DE LESA HUMANIDAD DURANTE
EL CONFLICTO ARMADO ENTRE LOS AÑOS 1980 AL 2000
LORENA G. BANDA DE LA CRUZ, SUSAN I. POLO SANTILLÁN
LABORATORIO DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y GENÉTICA DEL INSTITUTO DE MEDICINA LEGAL –
MINISTERIO PÚBLICO DEL PERÚ

Introducción
El presente caso trata de restos de osamentas humanas exhumados en abril del año
2013 de un lugar de entierro en el distrito de Morcolla a 3452 msnm en la provincia de
Sucre departamento de Ayacucho en la región centro sur del Perú. Es en esta región
donde se registra la mayor cantidad de víctimas y desaparecidas durante el conflicto
interno desatado entre la agrupación política PCP-Sendero Luminoso y las fuerzas del
orden del país durante los años 1980 al 2000. Las características del suelo de la zona
4
GCLATIH - Grupo Científico Latino-Americano de Trabajo Sobre Identificación Humana
de exhumación tienen una formación litológica del tipo sedimentario formado por
arenas, gravas y arcillas y de tipo volcánico. Las osamentas recuperadas estaban
esqueletizadas, posterior al estudio antropológico respectivo para su
individualización se recolecto fragmentos de fémur. Con fines de identificación de
los restos hallados se obtuvo muestras de dos grupos familiares directos de dos
individuos desaparecidos durante los años 1983 y 1984 que consistieron en muestras
de sangre con los cuales se realizó el cotejo correspondiente.
Materiales y Método
Los fragmentos de restos oseos una vez tratados y pulverizados pasaron por dos
procesos de descalcificación, la primera a base de un tampón de EDTA 0.5 M y SDS
10% el cual se incubo durante 24 h a 56 ° C, luego se añade un tampón Tris / HCl 10
mM, EDTA 50 mM, SDS 0.1%, DTT 39 mM y proteinasa K 20 mg/ml. Se aisló el ADN por
extracción con el método QIAamp® DNA Investigator Purification Kit (Qiagen). El
ADN aislado se concentró y se purificó adicionalmente por ultrafiltración en columnas
de Amicon Ultra 15 (Merck, Millipore). Las muestras de sangre de los familiares de los
individuos desaparecidos se recogieron en tarjetas FTA (Whatman FTA) y el ADN se
purificó por el sistema de Purificacion de FTA (Whatman® FTA® purification reagent).
El ADN purificado fue amplificado utilizando el sistema Power Plex 16® System (15
Marcadores Microsatélites STR Autosómicos más 01 marcador para la determinación
de sexo) (Promega Corporation) con las condiciones del fabricante. Para la
detección de Productos Amplificados se utilizó el Sistema de Electroforesis Capilar y
detección por Fluorescencia mediante el Analizador Genético Automatizado ABI HID
3500 (Applied Biosystems). La probabilidad de paternidad se calculó usando el
programa estadístico Familias 2.0 utilizando la Base de Datos de Frecuencias
Poblacionales Hispanoamericana.
Resultado y Discusión
En las muestras registradas con código B y C (fragmento de restos óseos) se
obtuvieron perfiles genéticos completos. Así mismo se obtuvo perfiles genéticos
completos en las muestras de sangre de ambos grupos familiares, como se detalla
en la Tabla N°1.

5
GCLATIH - Grupo Científico Latino-Americano de Trabajo Sobre Identificación Humana
Tabla N°1 Perfiles Genéticos usando el sistema Power Plex16, B y C restos óseos, H1:
Hijo del primer grupo familiar, H2: Hijo del primer grupo familiar y H3: Hijo del segundo
grupo familiar.
MARCADOR B C H1 H2 H3
D3S1358 15 / 17 15 / 16 14 / 15 17 / 17 16
TH01 7 / 9.3 7 / 9.3 7 7 7 / 9.3
D21S11 31.2 / 31.2 31.2 / 32.2 28 / 31.2 28 / 31.2 31 / 31.2
D18S51 12 / 15 14 / 17 15 / 16 12 / 16 14
PENTA E 12 / 18 13 / 18 18 / 21 12 / 24 16 / 17
D5S818 7 / 11 11 11 7 / 12 7 / 12
D13S317 9 9 9 / 12 9 / 12 10 / 12
D7S820 8 / 10 10 / 11 8 / 11 10 / 11 11 / 12
D16S539 9 / 12 9 / 13 11 / 12 9 / 11 9
CSF1PO 12 12 12 12 12
PENTA D 10 / 11 9 / 12 10 / 13 11 10 / 11
VWA 16 / 17 17 / 18 17 / 18 16 / 18 15 / 16
D8S1179 12 / 14 10 / 14 12 / 14 12 13
TPOX 8 11 8 8 8 / 12
FGA 18 / 24 20 / 25 18 / 22 18 / 22 20 / 25
Amelogenina X / Y X / Y X X / Y X

Después de realizar el cotejo de los genotipos de los restos óseos con los genotipos
de los dos grupos familiares se obtuvo lo siguiente; el análisis entre el genotipo del
resto óseo B con respecto al del hijo 1 determino un índice de Identificación
combinado de 21804.5929132977 y una probabilidad de paternidad de 99.995414 %,
el análisis entre los genotipos del resto óseo B con respecto al hijo 2 determino un
índice de Identificación combinado de 142881.337089639 y una probabilidad de
paternidad de 99.999300 %. En el cotejo de los genotipos del hijo 3 y del resto óseo B
no se encontró coincidencia en siete marcadores (D3S1358, D18S51, PENTA E,
D13S317, D7S820, D8S1179 y FGA). En el cotejo de los genotipos del hijo 3 y el resto
óseo C no se encontró coincidencia en siete marcadores (PENTA E, D5S818, D13S317,
PENTA D, VWA, D8S1179 y TPOX).
Conclusión
Numerosos estudios señalan que la densidad del hueso es un factor importante que
influye en la preservación del ADN en este tipo de muestras y normalmente se
6
GCLATIH - Grupo Científico Latino-Americano de Trabajo Sobre Identificación Humana
encontraría menos degradado en las piezas óseas más densas del esqueleto como
el fémur y la tibia. El éxito en la obtención de información genética a partir de restos
óseos está condicionado así mismo por el tipo de estructura ósea y el grado de
conservación que va a estar condicionado a la forma o tipo de enterramiento,
características del ambiente y suelos en el que se encuentra depositado el resto
óseo, temperatura, humedad, PH, agentes biológicos, físicos, presencia de ciertos
compuestos en el suelo y otros factores ambientales. Para nuestro caso los restos
óseos tienen más de 30 años de antigüedad por lo que se requirió que el proceso sea
más minucioso. Como resultado se obtuvo ADN que pudo ser amplificado por PCR.
Para la muestra de referencia se obtuvo de familiares más apropiados es decir de
primer grado para obtener una alta probabilidad de identificacion (DNA Commission
of the International Society for Forensic Genetics: Recommendations regarding the
role of forensic genetics for disaster victim identification), para el caso hijos de dos
grupos familiares, de los cuales se obtuvo una probabilidad de identificación de
99.995414% para el hijo1 y una probabilidad de paternidad de 99.999300% para el
hijo2 de un grupo familiar.

PROYECTO DE VALIDACIÓN DE EXTRACCIÓN DIFERENCIAL AUTOMATIZADA EN
EL EQUIPO BIOMEK® 3000 DE BECKMAN COULTER™ PARA PROCESAR MUESTRAS
FORENSES
OSCAR ANTONIO BARRERA VILLALOBOS
PROCURADURÍA GENERAL DE JUSTICIA DEL DISTRITO FEDERAL, MÉXICO

La extracción diferencial de muestras forenses en casos de violación, es una de las
múltiples actividades que se realizan en los laboratorios de análisis genéticos de
manera cotidiana. Así mismo, ésta es una de las principales peticiones que
cotidianamente son solicitadas en el laboratorio de Genética Forense de la
PGJCDMX, por lo cual es necesario dedicar tiempo y recursos materiales y humanos
para obtener resultados satisfactorios para la autoridad ministerial y la sociedad en
general.
7
GCLATIH - Grupo Científico Latino-Americano de Trabajo Sobre Identificación Humana
Debido a lo anterior y ante la necesidad de minimizar tiempos, carga de trabajo,
errores humanos y así mismo, con la implementación de sistemas de calidad; en
nuestro laboratorio hemos comenzado con un proyecto de validación de extracción
diferencial automatizada de muestras forenses producto de violación utilizando el
equipo automatizado Biomek 3000® de Beckman CoulterTM, que cuenta con las
plataformas instaladas para utilizar el kit de extracción Diferencial Differex, así como
la purificación de ADN de muestras forenses por medio del kit DNA-IQ de la casa
comercial Promega.
Material y Métodos
1. EXTRACCION DIFERENCIAL AUTOMATIZADA DE CELULAS ESPERMATICAS
MUESTRAS EMPLEADAS
Se utilizaron hisopos con muestras control de un individuo del sexo masculino (células
espermáticas) y un individuo de sexo femenino (células epiteliales vaginales). Una
alícuota por duplicado de las muestras fue extraída y purificada por medio del kit SV
isolation system, así como cuantificada por medio del kit Quantifiler Duo y
amplificada para obtener los perfiles genéticos de referencia por medio de los kits
Powerplex Fusion (PPF) y Powerplex Y23 (PPY23).
PREPARACION DE MUESTRAS
El estudio de extracción diferencial se realizó utilizando una cantidad constante de
células epiteliales por muestra y utilizando diluciones de la cantidad de células
espermáticas presentes en las mismas (1:1, 1:10, 1:100, 1:500 y 1:1000). A partir de las
alícuotas anteriores se obtuvieron series de repeticiones de: 5 controles de células
espermáticas puras, 5 controles de células epiteliales puras y 5 repeticiones de
mezclas de células epiteliales con cada una de las diluciones elaboradas. Se
tomaron alícuotas para realizar frotes y evaluar la cantidad de células espermáticas
y de células epiteliales en las muestras por observación al microscopio.
PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS EN EL EQUIPO AUTOMATIZADO BIOMEK 3000 (LISIS
Y SEPARACIÓN DIFERENCIAL POR DIFFEREX SYSTEM PROTOCOL Y PURIFICACIÓN POR
MEDIO DE DNA-IQ SYSTEM PROTOCOL)
La extracción diferencial se realizó por medio del protocolo Differex como lo indica
el proveedor, posteriormente, se realizó la purificación de ADN de las fracciones
8
GCLATIH - Grupo Científico Latino-Americano de Trabajo Sobre Identificación Humana
espermáticas y epiteliales de las muestras por medio del protocolo DNA IQ for Differex
en el equipo Biomek 3000.
2. CUANTIFICACION Y NORMALIZACIÓN AUTOMATIZADA DE LAS MUESTRAS
Tras la extracción diferencial y purificación de las muestras, se realizó la
cuantificación de las fracciones espermáticas (M) y epiteliales (F) por medio del kit
de Promega Plexor HY, preparada por medio del protocolo automatizado para PCR
en tiempo real Plexor HY en el equipo Biomek 3000 y cuantificada en el equipo
Stratagene Mx3005P qPCR System de la marca Agilent.
La normalización de las muestras para el proceso de amplificación se obtuvo a través
de los datos obtenidos por medio del software Plexor Analysis Software de Promega.
3. AMPLIFICACION AUTOMATIZADA DE MUESTRAS DE EXTRACCION DIFERENCIAL
Para la amplificación automatizada las muestras, se realizó tomando solamente tres
réplicas al azar de los controles de células espermáticas, controles de células
vaginales, mezclas de células epiteliales con diluciones de células espermáticas y
blancos de reactivos. La amplificación se ajustó a 0.5ng/µL de ADN autosómico y/o
masculino y realizó por medio de los kits de amplificación de STRs Powerplex Fusion
(PPF) y Powerplex Y23 (PPY23) de Promega, preparados por medio del protocolo
automatizado para amplificación NormSTR en el equipo Biomek 3000 y amplificados
en el equipo GeneAmp PCR System 9700 de la marca Applied Biosystems.
cío).
4. ELECTROFORESIS DE LAS MUESTRAS DE EXTRACCION DIFERENCIAL
Para determinar los alelos de los diferentes marcadores de los sistemas Powerplex
Fusion (PPF) y Powerplex Y23 (PPY23), se realizó un corrimiento electroforético y
escaneo génico, utilizando el equipo Genétic Analyzer ABI PRISM 3130xl operado por
medio del software Data Collection y procesando los datos obtenidos a través del
software Gene Mapper ID v3.2.
Resultados
Hemos podido observar a través de éste procedimiento que la mínima cantidad de
células espermáticas necesarias para obtener un perfil genético autosómico
completo y diferenciado es a partir de 10 células espermáticas por campo, así mismo
9
GCLATIH - Grupo Científico Latino-Americano de Trabajo Sobre Identificación Humana
a, a partir de esta concentración, hemos obtenido perfiles genéticos autosómicos y
haplotipos con una altura y balance adecuado.

CASO VILLATORO: “AL SILENCIO DEL MICRÓFONO, EL ADN GRITA”
ZINTIA MOYA
LABORATORIO SEROLOGÍA- GENÉTICA FORENSE, MINISTERIO PÚBLICO, HONDURAS

El caso del secuestro seguido de asesinato del periodista Ángel Alfredo Villatoro fue
un caso emblemático y de gran impacto social, hecho ocurrido entre el 9 al 15 de
mayo de 2012 en Tegucigalpa, Honduras con el hallazgo del cuerpo.
Haciendo especial hincapié en los análisis genéticos realizados a los indicios
encontrados en el allanamiento de la casa donde se pudo comprobar por medio
de la obtención del perfil genético del Sr. Villatoro que fue el lugar donde se mantuvo
en cautiverio.
DESCRIPCION DEL CASO
A partir del allanamiento de la casa en mención geolocalizada mediante
triangulación telefónica realizada por el cuerpo de investigación criminal de la
policía nacional y la ropa que vestía el día del hallazgo del cuerpo.
Se analizaron 22 diferentes indicios divididos en 2 dictámenes conforme al avance
cronológico de la investigación.
Cabe mencionar que los indicios consistentes en un vaso de vidrio y una botella
plástica eran de especial importancia para la vinculación de la escena (casa) con
el ofendido en cautiverio.
Estos indicios de cantidad mínima de muestra (saliva) fue posible procesarlos
mediante el kit de extracción y purificación DNA IQ SYSTEM.
Se realizó la amplificación por medio de PCR y posteriormente electroforesis capilar
en el ABI PRISM 310 ANALIZADOR GENETICO.
El perfil genético obtenido coincidió con el perfil genético del Sr. Villatoro
RESULTADOS
10