Características morfo-anatómicas, fisiológicas y bioquímicas de plantas jóvenes de olivo

161 Pages·2013·0.96 MB·Spanish

by  José Luis García

INSTITUTO DE RECURSOS NATURALES Y Y
UNIVERSIDAD DE SEVILLA
AGROBIOLOGÍA DE SEVILLA

CARACTERÍSTICAS MORFO-ANATÓMICAS, FISIOLÓGICAS Y BIOQUÍMICAS DE
PLANTAS JÓVENES DE OLIVO (Olea europaea L.) OBTENIDAS IN VITRO, EN
FUNCIÓN DE LA FUENTE Y CONCENTRACIÓN DE NITRÓGENO

Memoria presentada por el licenciado D. José Luis García
Fernández para optar al grado de Doctor en Biología

Sevilla, Febrero de 1999

DIRECTORES:

DR. ANTONIO TRONCOSO DE ARCE DR. RAFAEL SARMIENTO SOLÍS
Profesor de Investigación del CSIC Colaborador Científico del CSIC

TUTOR

DR. FRANCISCO JAVIER FLORENCIO BELLIDO
Profesor Titular de Bioquímica Vegetal y Biología
Molecular de la Universidad de Sevilla

AGRADECIMIENTOS

Este trabajo ha sido realizado en el Instituto de Recursos Naturales y
Agrobiología de Sevilla (C.S.I.C.), por lo que quiero agradecer en primer lugar a la
Dirección del Instituto y a todo su personal el apoyo que me han brindado en todo
momento.

En segundo lugar, pero no por ello menos importante, quiero agradecer a los
Dres. Antonio Troncoso de Arce y Rafael Sarmiento Solís, directores de este trabajo,
todo el tiempo que me han dedicado, su constante apoyo y colaboración, así como
por su amistad.

Al Dr. Francisco Javier Florencio Bellido por haber accedido amablemente a
ejercer de tutor de esta tesis.

A la Dra. Carmen Mazuelos le agradezco su colaboración en la realización de
los análisis de elementos. Pero, además, tengo que resaltar su calidad humana,
ejemplo para todos los que tenemos la suerte de trabajar con ella.

Al Dr. Eduardo Leidi por su ayuda en la realización de este trabajo.

Al Prof. Shimon Lavee le agradezco sus siempre atinadas sugerencias que han
ayudado a enriquecer este trabajo.

A la Dra. Beatriz Cubero por su valiosa ayuda en la revisión del capítulo sobre
marcadores polipéptidicos.

A mis compañeras de laboratorio, Carmen Grande y Asunción Castro que,
además de colaborar con su trabajo a esta Tesis, me han otorgado su amistad.

A Manuel Cantos, Juana Liñán, Carmen Villalón y Carlos Carretero por su
amistad y colaboración.

A mis amigos, Ana, José Carlos, Rafa, Bernardo y tantos otros que me han hecho
y me hacen agradable el trabajo de todos los días.

A Mercedes, que me ha apoyado, ayudado y aguantado todo este tiempo, por
todo.
ÍNDICE
ABREVIATURAS EMPLEADAS.................................................................................III
ÍNDICE DE FIGURAS..............................................................................................IV
ÍNDICE DE TABLAS ................................................................................................VI
I. INTRODUCCIÓN GENERAL Y OBJETIVOS ..........................................................1
1. COMPARACIÓN DE LA CAPACIDAD DE GERMINACIÓN DE EMBRIONES
AISLADOS Y CULTIVADOS IN VITRO, SEMILLAS Y SEMILLAS CON
ENDOCARPO (HUESOS) DE OLIVO.................................................................11
1.1. INTRODUCCIÓN.........................................................................................13
1.2. MATERIAL Y MÉTODOS...............................................................................15
1.3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN.......................................................................17
2. INFLUENCIA DE LA FUENTE Y CONCENTRACIÓN DE N SOBRE EL
CRECIMIENTO Y LA COMPOSICIÓN DE EMBRIONES DE OLIVO
GERMINADOS IN VITRO..................................................................................23
2.1. INTRODUCCIÓN.........................................................................................25
2.2. MATERIAL Y MÉTODOS...............................................................................28
2.3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN.......................................................................31
2.3.1. Desarrollo de las plántulas...................................................................31
2.3.1.1. Pérdidas de embriones.............................................................31
2.3.1.2. Crecimiento del tallo...............................................................32
2.3.1.3. Formación de hojas.................................................................35
2.3.1.4. Peso fresco, peso seco y grado de hidratación.........................38
2.3.2. Composición mineral..........................................................................48
2.3.3. Fracciones de N...................................................................................55
2.3.4. Aminoácidos libres..............................................................................59
3. INFLUENCIA DE LA FUENTE Y CONCENTRACIÓN DE N SOBRE EL
CRECIMIENTO DE PLÁNTULAS DE OLIVO EN INVERNADERO.......................63
3.1. INTRODUCCIÓN.........................................................................................65
3.2. MATERIAL Y MÉTODOS...............................................................................66

I
3.3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN.......................................................................68
4. INFLUENCIA DE LA FUENTE DE CARBONO EN LA PROPAGACIÓN IN
VITRO DEL OLIVO............................................................................................81
4.1. INTRODUCCIÓN.........................................................................................83
4.2. MATERIAL Y MÉTODOS...............................................................................85
4.3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN.......................................................................87
5. ANÁLISIS PRELIMINAR DE MARCADORES POLIPEPTÍDICOS
RELACIONADOS CON LA JUVENILIDAD DE LA PLANTA DE OLIVO..............97
5.1. INTRODUCCIÓN.........................................................................................99
5.2. MATERIAL Y MÉTODOS.............................................................................102
5.3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN.....................................................................103
II. DISCUSIÓN GENERAL ....................................................................................109
III. CONCLUSIONES............................................................................................121
IV. BIBLIOGRAFÍA...............................................................................................127

II
ABREVIATURAS EMPLEADAS

%GH Porcentaje de hidratación PVC Cloruro de polivinilo
C Grados Celsius RuBisCo Ribulosa 1,5-bifosfato
E.m-2.s-1 Unidad de irradiancia carboxilasa/oxidasa
ACC Ácido 1-aminociclopropano S.E.M. Error estándar de la media
1-carboxílico SDS Dodecil sulfato sódico
ADN Ácido desoxirribonucléico ser Serina
ala Alanina sol.sat. solución saturada
arcsen Arcoseno thr treonina
arg Arginina tyr Tirosina
ARN Ácido ribonucléico val Valina
ARNm ARN mensajero
asp Ácido aspártico
ATP Trifosfato de adenosina
BSA Seroalbúmina bovina
CE Conductividad eléctrica
cv cultivar
cys Cisteína
dS/cm unidad de conductividad
eléctrica
g Aceleración gravitatoria
GDP Difosfato de guanosina
glu Ácido glutámico
gly Glicina
GTP Trifosfato de guanosina
his Histidina
HPLC Cromatografía líquida de alta
eficacia
ile Isoleucina
kD Kilodalton
leu Leucina
lys Lisina
M.D.S. Mínima diferencia signifi-
cativa
mA Miliamperios
MDH Manitol deshidrogenasa
met Metionina
NTP Nucleósido-5’-trifosfato
OM Olive Medium
p.s. Peso seco
phe Fenilalanina
PITC Fenilisotiocianato
PMSF Fluoruro de metil fenil
sulfonilo
ppm Partes por millón
pro Prolina

III
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Posibles vías de expansión del cultivo del olivo por el
Mediterráneo..........................................................................................4
Figura 1.1. Tanto por ciento de germinación de semillas con endocarpo
(huesos) y semillas de distintos cultivares de olivo en
condiciones de invernadero..................................................................18
Figura 2.1. Longitud media de las plántulas obtenidas en la prueba 1
para cada tratamiento...........................................................................32
Figura 2.2. Longitud media de las plántulas obtenidas en la prueba 2
para cada tratamiento...........................................................................34
Figura 2.3. Longitud media de las plántulas obtenidas en la prueba 3
para cada tratamiento...........................................................................35
Figura 2.4. Promedio de pares de hojas por plántula obtenido en la
prueba 1 para cada tratamiento.............................................................35
Figura 2.5. Promedio de pares de hojas por plántula obtenido en la
prueba 2 para cada tratamiento.............................................................36
Figura 2.6. Promedio de pares de hojas por plántula obtenido en la
prueba 3 para cada tratamiento.............................................................37
Figura 2.7. Peso fresco medio por plántula para cada tratamiento en la
prueba 1...............................................................................................38
Figura 2.8. Peso fresco medio por plántula obtenido para cada
tratamiento en la prueba 2....................................................................40
Figura 2.9. Peso fresco medio por plántula obtenido para cada
tratamiento en la prueba 3....................................................................41
Figura 2.10. Resumen de los resultados de las pruebas 1, 2 y 3 para la
longitud de las plántulas.......................................................................43
Figura 2.11. Resumen de los resultados de las pruebas 1, 2 y 3 para el
número de pares de hojas por plántula.................................................43
Figura 2.12. Resumen de los resultados de las pruebas 1, 2 y 3 para el
peso fresco por plántula........................................................................45
Figura 3.1. Crecimiento de la plántula de olivo (6 meses) en sustrato de
arena, en cada tratamiento de N...........................................................69
Figura 3.2. A: Evolución de la concentración de N-NH en la solución
4
nutritiva en los contenedores.
B: Evolución de la concentración de N-NO en la solución
3
nutritiva en los contenedores................................................................74
Figura 3.3. Experimento 4: Crecimiento de la plántula de olivo (9 meses)
en sustrato de arena en cada tratamiento de N......................................76
Figura 3.4. Crecimiento medio de la plántula de olivo en relación con el
tiempo de duración del experimento....................................................77
Figura 3.5. Crecimiento de las plántulas de olivo (9 meses) en sustrato de
IV
arena y turba (1:1 v/v) en cada tratamiento...........................................79
Figura 3.6. Crecimiento de las plántulas de olivo (11 meses) en sustrato
de arena y turba (1:1 v/v) en cada tratamiento de NH NO ...................80
4 3
Figura 4.1. Longitud de los tallos (mm) y pares de hojas formados por
explantos uninodales de olivo con dos yemas tras las
aplicaciones crecientes de NH NO a un medio basal
4 3
conteniendo 15.96 mM de nitrato y 30 g.l-1 de manitol........................95
Figura 5.1. Perfiles electroforéticos de: (1) hojas de plántula juvenil
obtenida por germinación de embriones in vitro; (2) Hojas de
plántula juvenil de semilla creciendo en el exterior; (3) hojas
de planta adulta cultivada en maceta; (4) hojas de planta
adulta creciendo en condiciones de campo; (5) hojas de
vareta, creciendo de la base del tronco del árbol y (6) extracto
de flores recogidas antes de la antesis.................................................104

V
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1.1. Composición del medio de cultivo utilizado para la
germinación in vitro.............................................................................17
Tabla 1.2. Tanto por ciento de germinación de embriones aislados y
cultivados in vitro en medio OM de distintos cultivares, a los
10 días de la siembra............................................................................20
Tabla 1.3. Días necesarios para la obtención de plántulas viables a partir
de huesos, semillas o embriones de olivo.............................................21
Tabla 2.1. Composición del medio base de cultivo utilizado para la
germinación de embriones in vitro.......................................................28
Tabla 2.2. Incidencia de cada tratamiento en la mortalidad de los
embriones cultivados in vitro................................................................31
Tabla 2.3. Peso seco y contenido de agua (% GH) encontrado para cada
tratamiento en la prueba 1....................................................................39
Tabla 2.4. Peso seco y contenido de agua (% GH) encontrado para cada
tratamiento en la prueba 2....................................................................41
Tabla 2.5. Peso seco y contenido de agua (% GH) encontrado para cada
tratamiento en la prueba 3....................................................................42
Tabla 2.6. Composición mineral de las plántulas obtenidas en los
distintos tratamientos (Media de las pruebas 1 y 2)...............................48
Tabla 2.7. pH final del medio de cultivo tras 60 días de cultivo in vitro
para cada tratamiento...........................................................................50
Tabla 2.8. Composición mineral de las plántulas obtenidas en los
distintos tratamientos para la prueba 3..................................................53
Tabla 2.9. Fracciones de N en relación con los tratamientos de las
pruebas 1 y 2 (Media de ambas pruebas)..............................................55
Tabla 2.10. Niveles de aminoácidos libres (mol.g-1 p.s.) tras los distintos
tratamientos nitrogenados (Media de las pruebas 1 y 2)........................62
Tabla 3.1. Composición mineral de las hojas de plántulas de olivo
cultivadas (6 meses) en sustrato de arena estéril en relación
con los tratamientos nitrogenados (Experimento 3)...............................71
Tabla 3.2. Fracciones de N en relación con los tratamientos
nitrogenados (Experimento 3)...............................................................72
Tabla 3.3. Contenidos de N-NH y N-NO en las soluciones nutritivas
4 3
después de 100 días de almacenamiento en los contenedores
(Experimento 3)....................................................................................75
Tabla 3.4. Contenido de N-NO en el sustrato de cultivo, 6 días después
3
de recibir un riego con soluciones nutritivas.........................................75
Tabla 3.5. Composición mineral de las hojas de plántulas de olivo
cultivadas (9 meses) en sustrato de arena estéril en relación
con los tratamientos nitrogenados.........................................................78
VI
Tabla 4.1. Composición del medio de cultivo utilizado OM.................................86
Tabla 4.2. Longitud media (mm) de los explantos obtenidos en cada
subcultivo para la prueba A..................................................................87
Tabla 4.3. Número medio de pares de hojas obtenido en cada
subcultivo para la prueba A..................................................................89
Tabla 4.4. Efecto de las tres concentraciones de carbohidrato probadas
sobre explantos uninodales de olivo in vitro con 2 yemas
axilares, tras 60 días de cultivo.............................................................91
Tabla 4.5. Efecto del azúcar de procedencia y de destino sobre el
crecimiento de explantos de olivo in vitro............................................92

VII