avaliação do potencial antiviral do extrato bruto da planta caesalpinia echinata e da rifampicina

72 Pages·2015·1.43 MB·Portuguese

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
INSTITUTO DE MEDICINA TROPICAL
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

RENATO FERREIRA DE ALMEIDA JUNIOR

AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTIVIRAL DO EXTRATO BRUTO DA PLANTA
CAESALPINIA ECHINATA E DA RIFAMPICINA CONTRA O VÍRUS DENGUE-2
EM CULTURA DE CÉLULAS

Natal
Março/ 2015
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTIVIRAL DO EXTRATO BRUTO DA PLANTA
CAESALPINIA ECHINATAE DA RIFAMPICINA CONTRA O VÍRUS DENGUE-2 EM
CULTURA DE CÉLULAS

Dissertação de Mestrado
Apresentada à Coordenação da Pós
Graduação de Ciências Biológicas

da Universidade Federal do Rio
Grande do Norte, como Requisito
para a obtenção do Título Mestre em
Ciências Biológicas.

Orientador: Dr.Kleber Juvenal Silva
Farias

Co-orientador: Dr. Josélio Maria
Galvão de Araújo

Natal
Março/2015
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
INSTITUTO DE MEDICINA TROPICAL
CURSO DE BIOMEDICINA

AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTIVIRAL DO EXTRATO BRUTO DA PLANTA
CAESALPINIA ECHINATAE DA RIFAMPICINA CONTRA O VÍRUS DENGUE-2 EM
CULTURA DE CÉLULAS

elaborada por Renato Ferreira de Almeida Junior

e aprovada por todos os membros da Banca examinadora como requisito parcial à obtenção
do título de Mestre em Ciências Biológicas.

Natal, 16 de Março de 2015
BANCA EXAMINADORA

_____________________________________________
Prof. Dr José Veríssimo Fernandes
(Departamento de Microbiologia e Parasitologia)

_________________________________________
Prof. Dr. Francisco Fabio Marques da Silva.
(Universidade Federal de Campina Grande)

_________________________________________
Profª. Drª. Vânia Sousa Andrade
(Departamento de microbiologia e parasitologia)
Catalogação da Publicação na Fonte. UFRN / Biblioteca Setorial do Centro de Biociências

Almeida Júnior, Renato Ferreira.
Avaliação do potencial antiviral do extrato bruto da planta Caesalpinia Echinata e da rifampicina contra
vírus dengue-2 em cultura de células / Renato Ferreira Almeida Júnior. – Natal, RN, 2015.

70 f.: il.

Orientador: Dr. Kleber Juvenal Silva Farias.
Coorientador: Dr. Josélio Maria Galvão de Araújo

Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Biociências. Programa de
Pós-Graduação em Ciências Biológicas.

1. Vírus dengue-2. – Dissertação. 2. Caesalpinia echinata. – Dissertação. 3. Rifampicina. – Dissertação. I.
Farias, Kleber Juvenal Silva. II. Araújo, Josélio Maria Galvão de. III. Universidade Federal do Rio Grande do
Norte. IV. Título.

RN/UF/BSE-CB CDU 614.4
Dedico este trabalho aos meus pais Renato e Claudia,
meu irmão Ruan,
toda minha família
e minha Noiva Marlyanne
Agradecimentos

Aos meus pais por toda dedicação e paciência que sempre tiveram comigo;
Ao meu professor, orientador e amigo Dr. Kleber Farias pela confiança depositada em mim, e
por sempre me guiar em minhas duvidas;
Ao meu também orientador Professor Josélio Galvão por sempre estar presente em qualquer
dificuldade;
Aos colegas de laboratório, Tábata, Yasmin e Fabiana pela colaboração nos experimentos;
A todos os colegas do Laboratório de Biologia Molecular de Doenças Infeciosas e do Câncer
pela contribuição que sempre dispuseram para a realização de todos os ensaios que
realizamos;
A todos os professores que deram aula no curso da pós-graduação, pela dedicação e os
ensinamentos transmitidos a nós;
A todos os colegas de turma;
A todos os funcionários do departamento de Microbiologia e Parasitologia do Centro de
Biociências;
Aos funcionários do Instituto de Medicina Tropical;
Aos meus familiares que sempre me deram apoio e incentivo;
Aos professores participantes da banca examinadora,
A minha noiva Marlyanne por sempre estar ao meu lado, me dando apoio, incentivo e tendo
muita paciênciaao longo desses cinco anos e meio.
A todos aqueles que direta ou indiretamente colaboraram para que este trabalho fosse
realizado.
RESUMO
Os vírus dengue pertence à família Flaviviridae e ao gênero Flavivirus, sendo composto por 4
sorotipos antigenicamente distintos, são considerados os arbovírus mais importantes no
mundo por causar altas taxas de morbidade e mortalidade em regiões tropicais e subtropicais
do planeta, colocando em risco até 3,6 bilhões de pessoas em mais de 100 países. Por ser uma
doença com amplo espectro clínico e por não possuir vacina ou tratamento eficaz, o estudo de
possíveis antivirais que visam diminuir a viremia do paciente é de suma importância, já que
este é um dos fatores que pode levar a febre hemorrágica da dengue e a síndrome do choque
da dengue que são as formas grave da doença. No presente estudo foi avaliado o potencial
antiviral do extrato da folhada planta Caesalpinia echinata contra o vírus dengue-2 (DENV-2)
em cultura de células C6/36 e Vero e a ação antiviral da Rifampicina em células Vero. A
escolha da Caesalpinia echinata se deve ao fato de que já foi observada sua ação anti-
inflamatória e antimalárica, além de não ter sido encontrado nenhum trabalho que tenha
avaliado seu potencial de ação frente a vírus. A Rifampicina foi escolhida por demonstrado
ação antiviral, principalmente contra os poxvirus, porém poucos sãos os relatos da utilização
deste fármaco contra vírus de RNA. O resultado foi obtido através da quantificação da carga
viral pela técnica da qRT-PCR em Tempo Real. As células infectadas por DENV-2 foram
submetidas ao tratamento pelo período de 7 dias em diferentes concentrações do extrato da
planta Caesalpinia echinataque variou entre 0,68 a 0,0068mg/mL. Não foi possível observar
neste estudo, evidências de inibição significativa da replicação do vírus DENV-2 em ambas as
culturas celulares. ARifampicina foi utilizada em diferentes condições de tratamento, no qual
foi avaliado ao longo de 72 horas a carga viral produzida nas células Vero.Nas condições de
tratamento pós-infecção e no ensaio virucida o fármaco apresentou atividade antiviral,
reduzindo a taxa de replicação em 100 vezes em relação ao controle. De acordo com os
nossos resultados conclui-se que a Rifampicina mostrou-se eficaz no combate a infecção do
DENV-2 em cultura de células Vero.

Palavras-chave: DENV-2, células C6/36 e Vero,Caesalpinia echinata, Rifampicina,
quantificação, qRT-PCR em tempo real e PFU.
ABSTRACT
The dengue virus belongs to the Flaviviridae family and the Flavivirus genus, consisting of
four serotypes antigenically distinct, are considered the most important arbovirus in the world
to cause high rates of morbidity and mortality in tropical and subtropical regions of the world,
threatening to 3, 6 billion people in over 100 countries. Because it is a disease with a wide
clinical spectrum and has no vaccine or effective treatment, the study of possible antiviral
drugs aimed at reducing viremia of patients is of paramount importance, since this is one of
the factors which can lead to dengue hemorrhagic fever and dengue shock syndrome that are
severe forms of the disease. In the present study we evaluated the antiviral potential of the leaf
extract of the plant Caesalpinia echinata against dengue-2 virus (DENV-2) in cultured C6/36
and Vero cells and the antiviral action of Rifampicin on Vero cells. The choice of Caesalpinia
echinata is due to the fact that has been observed its action anti-inflammatory and anti-
malarial , and not have been found no study evaluated its antiviral effect. Rifampin was
chosen was chosen for demonstrated antiviral action, especially against poxviruses, but few
sane reports usage of this drug against RNA viruses. The result was obtained by quantifying
the viral load bythe technique of Real-time qRT-PCR. Cells infected with DENV-2 were
subjected to treatment for 7 days in different concentrations of plant extract Caesalpinia
echinata (0.68 - 0,0068mg / ml). As a result, we could not observe a inhibition significant of
virus replication in both cell cultures. The Rifampicin was used for different treatment
condition,which were evaluated over 72 hours the amount of viral load produced in Vero
cells, In the conditions treatment and the test virucidal theantiviral activity, which is capable
of reducing the rate of 100X replication as compared to control. According to our results we
can conclude that Rifampicin was effective in action against to infection DENV-2 in Vero cell
culture.
Keywords: DENV-2, C6/36 and Vero cell, Caesalpinia echinata, Rifampicin, quantification,
Real-Time qRT-PCR, Caesalpinia echinata and PFU.
LISTA DE ABREVIATURAS

ADE Infecção mediada por anticorpo
C Capsídeo
CC Concentração citotóxica a 50% da monocamada celular
50
Cap Catabolite gene activator protein
Depois de Cristo
d.C

Dendritic Cell-Specific Intercellular adhesion molecule-3-
DC-SING
Grabbing Non-integrin
DENV Vírus Dengue
DENV-1, DENV-2,
Vírus Dengue 1-4
DENV-3 e DENV-4
DMSO Dimetilsulfóxido
DNA Ácido desoxirribonucleico
DSS Síndrome do choque da dengue
E Envelope
FHD Febre Hemorrágica da dengue
FITC Isotiocianato de fluoresceína
HSV-1 e 2 Herpes Vírus Simplex tipo 1 e 2
IFI Imunofluorescência indireta
IFN Interferon
kDA Kilodaltons
L-15 Meio de Cultura Leibovitz-15
M Membrana
MIAF Mistura de fluido ascítico imune de camundongo
MT Motifs metiltransferase
MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide
NS1 Proteína não estrutural 1
NS2 A e B Proteína não estrutural 2
Ns3 Proteína não estrutural 3
Ns4 A e B Proteína não estrutural 4
Ns5 Proteína não estrutural 5
ORF Open Reading frame
PBS Tampão Fosfato-Salino
PCR Reação em cadeia de Polimerase
prM Pré-membrana
PV-1 Póliovírus tipo 1
RNA Ácido ribonucleico
SBF Soro Fetal Bovino