1 - Aus der Abteilung für Allgemein

89 Pages·2007·1.46 MB·German

Aus der
Abteilung für Allgemein- und Viszeralchirurgie
Chirurgische Universitätsklinik
der Albert-Ludwigs Universität Freiburg in Breisgau
(Ärztlicher Direktor: Prof. Dr. Dr. h.c. U.T. Hopt)

„Freisetzung von
neutrophilen Granulozyten aus dem Knochenmark
bei der akuten schweren Pankreatitis und deren Beteiligung am
Pankreatitis – assoziierten - Lungenschaden“
- Untersuchungen an einem etablierten Tiermodell an Ratten -

INAUGURAL-DISSERTATION
zur Erlangung des Medizinischen Doktorgrades
der Medizinischen Fakultät
der Albert-Ludwigs Universität
Freiburg im Breisgau

vorgelegt von
Cornelia Sabine Richter
geboren in Ludwigshafen am Rhein

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Dekan: Prof. Dr. med. Christoph Peters
1. Gutachter: PD Dr. med. Tobias Keck
2. Gutachter: PD Dr. med. Leonhard Mohr
Jahr der Promotion: 2007

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Meinen Eltern

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Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis:............................................................................................................6
1. Einleitung..........................................................................................................................8
1.1 Das Akute Atemnotsyndrom des Erwachsenen.......................................................................9
1.1.1 Ursachen...............................................................................................................................................9
1.1.2 Pathophysiologie................................................................................................................................10
1.1.3 Klinik..................................................................................................................................................11
1.1.4 Möglichkeiten der Behandlung...........................................................................................................12
1.2 Die akute Pankreatitis (AP).....................................................................................................13
1.2.1 Ursachen.............................................................................................................................................13
1.2.2 Pathophysiologie................................................................................................................................14
1.2.3 Diagnostik...........................................................................................................................................16
1.2.4 Möglichkeiten der Behandlung...........................................................................................................17
1.3 Neutrophile Granulozyten (PMNs).........................................................................................18
1.3.1 Bildung, Freisetzung und Eliminierung von PMNs............................................................................19
1.3.2 Transendotheliale Migration im Körperkreislauf...............................................................................20
1.3.3 Transendotheliale Migration in der Lungenstrombahn.......................................................................23
1.3.4 Wirkungsweise...................................................................................................................................24
1.4 Fragestellung.............................................................................................................................25
1.5 Überlegungen zur Versuchsdurchführung.............................................................................26
2. Material und Methoden...................................................................................................27
2.1 Experimentelles Protokoll........................................................................................................27
2.2 Induktion der Pankreatitis.......................................................................................................28
2.2.1 Tiere....................................................................................................................................................28
2.2.2 Chemikalien........................................................................................................................................28
2.2.3 Hilfsmittel...........................................................................................................................................29
2.2.4 Durchführung.....................................................................................................................................30
2.3 Gewinnung der Blutproben......................................................................................................34
2.4 Organgewinnung für die histologischen Untersuchungen....................................................34
2.5 Aufbereitung der gewonnenen Proben....................................................................................35
2.5.1 Amylase-Bestimmung........................................................................................................................35
2.5.2 FACS-Analyse....................................................................................................................................36
2.5.3 Histologische Untersuchungen...........................................................................................................39
2.6 Auswertung................................................................................................................................46
2.6.1 Auswertung der Amylase Messung....................................................................................................46
2.6.2 Auswertung der FACS-Analyse.........................................................................................................47
2.6.3 Auswertung der histologischen Präparate...........................................................................................47
2.6.4 Statistische Auswertungen..................................................................................................................48
3. Ergebnisse........................................................................................................................49
3.1 H&E- Färbung von Pankreas- und Lungenpräparaten........................................................49
3.1.1 Ergebnisse und Auswertung...............................................................................................................49
3.1.2 Zusammenfassung..............................................................................................................................50
3.2 Bestimmungen der Pankreas- α -Amylasewerte im Serum...................................................50
3.2.1 Ergebnisse...........................................................................................................................................50
3.2.2 Statistische Auswertung.....................................................................................................................52
3.2.3 Zusammenfassung..............................................................................................................................52
3.3 FACS (Fluorescent activated cell sorting)..............................................................................52
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3.3.1 Ergebnisse...........................................................................................................................................53
3.3.2 Statistische Auswertung.....................................................................................................................54
3.3.3 Zusammenfassung..............................................................................................................................55
3.4 Akkumulation von PMNs und BrdU-positiven Zellen in der Lunge....................................55
3.4.1 Anfärbung der Granulozyten mittels Naphthol-AS-D Chloracetatesterase Reaktion.........................56
3.4.2 Immunhistochemische Färbung der BrdU- positiven Zellen..............................................................60
3.4.3 Errechnete Infiltration der Lungen durch BrdU positiven Granulozyten...........................................63
3.4.4 Zusammenfassung.............................................................................................................................65
4. Diskussion........................................................................................................................66
4.1 Methodenkritik.........................................................................................................................66
4.2 Diskussion der Ergebnisse........................................................................................................68
4.2.1 Ausschüttung der PMNs in die Blutbahn...........................................................................................68
4.2.2 Infiltration von PMNs in die Lunge....................................................................................................70
4.3 Ausblick.....................................................................................................................................72
5. Zusammenfassung...........................................................................................................74
6. Literaturverzeichnis.........................................................................................................75
7. Curriculum Vitae.............................................................................................................86
8. Danksagung.....................................................................................................................89

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Abkürzungsverzeichnis:
°C Grad Celsius
BAL Bronchoalvoläre Lavage
µl Mikroliter
Abb. Abbildung
ABC Avidin-Biotin-Komplex
AEC 3- Amino- 9 Ethylcarbazol
ALI Akuter Lungenschaden ( = acute lung injury)
AP akute Pankreatitis
Aqua dest. Aqua destillata
ARDS Acute Respiratory distress Syndrome = Akutes Atemnotsyndrom des Erwachsenen
Art. Nr. Artikel Nummer
BD Beckton Dickinson
BrdU 2' Bromo 5' Desoxyuridine
C5a Komplementfaktor C5a
CD Membranständige glycoproteine
CD®BR / Crl: CD (SD) BR Lewis Ratten
CT Computertomographie
d.h. das heißt
DMSO Dimethylsulfoxid
EC Endothelzellen
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
etc. et cetera
Fa. Firma
FACS Fluorescent activated cell sorting
FCS Fetal calf serum
FiO2 Sauerstoffgehalt der Einatemluft
FITC Fluorescein Isothiocyanate
fMLP N-formyl-L-methionyl-L-Leucyl-phenylalanin
G-CSF Granulozyten stimulierender Faktor
GDOC Glycodesoxycholic acid = Glyco desoxy Cholsäure
GI-Blutung Gastro intestinale Blutung
GM-CSF Granulozyten / Makrophagen stimulierender Faktor
H & E Hämatoxilin- u. Eosin- Färbung
h. Stunde/n
i.m. intra muskulär
i.v. intra venös
ICAM-1, ICAM-2 Intercelluläres Adhäsions Molekül 1, Intercelluläres Adhäsions Molekül 2
Ig Immunglobulin
IL 1... IL 10 Interleukin 1 ... Interleukin 10
KG Körpergewicht
kg Kilogramm
KM Knochenmark
l Liter
LPS Lipopolysaccarid
Lsg. Lösung
LTB4 Leukotrien B4
M molar
MAC 1 Makrophagen Antigen 1
min. Minute/n
ml Milliliter
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mmHg Millimeter Quecksilbersäule
MMP 9 Matrix Metalloproteinase 9
MPO Myeloperoxidase
N normal
NaCE Naphtol - AS - D - Chloracetatesterase Reaktion
NADPH Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid Phosphat in der reduzierten Form
Nr. Nummer
o.a. oben angeführt
PAF Plättchenaktivierender Faktor ( = platelet activating Factor)
PALI Pankreatitis assoziierter Lungenschaden
PaO Sauerstoffpartialdruck
2
PBS Phosphat gepufferte Lösung
PEEP positive end expiratory pressure
PMNs Polymorphonukleäre Leukozyten
PSGL 1 P-Selektin glycoprotein ligand-1
p-Werte Signifikanzwerte
R-PE R-Phycoerythrin
SaO2 Sauerstoffsättigung im Blut
sec. Sekunde/n
SEM Standard error of the mean
SIRS Systemic inflamatory response syndrome
TEM Transendothelale Migration
TNF-α Tumor Nekrose Faktor Alpha
VCAM Vascular cell adhesion molecule
vs. versus

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1. Einleitung

Die akute Pankreatitis, die in 20% der Fälle in eine schwere Verlaufsform mit Nekrosen
übergeht, hat in der schweren Verlaufsform eine Letalität von 10% (Schmidt et al. 1995).
Organdysfunktionen treten zu 25% bei Patienten mit schwerer Pankreatitis auf. 60% der
Patienten, die in der ersten Woche versterben, weisen eine Lungenschädigung im Sinne eines
akuten Lungenversagens (Pancreatitis associated lung injury = PALI) auf (Mann et al. 1994).
In anderen klinischen Studien (Imrie et al. 1977) (Ranson et al. 1974) konnte eine
Lungenbeteiligung in bis zu 70% der Fälle gefunden werden und in 15% ist dieser
Lungenschaden schwer im Sinne eines Akuten Atemnotsyndrom des Erwachsenen (acute
respiratory distress syndrome = ARDS) (Ranson et al. 1974) (Ranson et al. 1973). Der Patho-
mechanismus für die Entstehung des ARDS im Rahmen der akuten Pankreatitis ist
weitgehend unklar. Allerdings ist allgemein akzeptiert, dass neutrophile Granulozyten
(Polymorphonuclear Leukocyte = PMN) für die Entstehung mit verantwortlich sind bzw.
sogar eine Schlüsselrolle spielen (Tate et al. 1983) (Guice et al. 1989) (Inoue et al. 1995).
Neutrophile Granulozyten finden sich zum einen im sogenannten Marginalen Pool, worunter
man den Pool an PMNs versteht, der sich mehr oder weniger adhärent an den Gefäß-
endothelien (= sequestriert) findet. Die Mechanismen der Adhäsion in systemischen Gefäßen
und der Lungenstrombahn sind unterschiedlich.
Der zweite große Pool der Neutrophilen Granulozyten liegt im Knochenmark, wo sie gebildet
werden.
Die Unterschiede der PMN - Adhäsion in den verschiedenen Stromgebieten - systemischer
Kreislauf vs. Lungenkreislauf - werden in dieser Arbeit ausführlich dargelegt und die Frage
der Herkunft der PMNs bei dem Pankreatitis assoziierten Lungenschaden (PALI) wird näher
untersucht.

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1.1 Das Akute Atemnotsyndrom des Erwachsenen
(= acute respiratory distress Syndrome = ARDS)

Beim ARDS handelt es sich um die klinische Beschreibung eines intensivmedizinischen
Krankheitsbildes, das viele verschiedene Ursachen haben kann. Die American – European
Consensus Conference 2000 (Abraham et al. 2000) definiert es als akuten Lungenschaden mit
nicht-kardiogenem Ödem und schwerer Hypoxie.
60% der ARDS-Patienten sterben in den ersten 2 Wochen nach Symptombeginn. Überlebende
Patienten haben oft einen langfristigen Bedarf an intensivmedizinischer Betreuung
(Mortelliti et al. 2002). Groß angelegte Studien nehmen eine Inzidenz zwischen 1,3 bis
5,3/100 000 EW an (Garber et al. 1996).
Den Kostenaufwand für das Gesundheitssystem haben Treggiari et. al (Treggiari et al. 2004)
zusammengefasst. Sie fanden, dass der mittlere Intensivstationsaufenthalt bei Trauma-
patienten von 2 Tagen bei Patienten, bei denen keine Lungenbeteiligung vorliegt, über 8 Tage
bei Patienten mit leichter Lungenbeteiligung (Acute Lung Injury = ALI) auf durchschnittlich
11 Tage bei Patienten mit ARDS ansteigt, was in US Dollar in letztem Fall Kosten von
48 300$ bedeutet.

1.1.1 Ursachen
Ausgelöst werden kann das ARDS durch direkte und indirekte Schädigungen.
Zu den direkten Ursachen gehören Aspiration von Mageninhalt, Beinaheertrinken,
Pneumonie, Lungenkontusion, Fettembolie, Inhalationstraumata, wie z.B. die akute
Rauchvergiftung und das Reperfusionsödem. Zu den indirekten werden Sepsis, Schock,
sonstige Traumata, Verbrennungen und die akute Pankreatitis gerechnet. Je nachdem, ob die
Noxen direkt oder indirekt wirken, ist der Schaden unterschiedlich geartet.
Im experimentell induzierten ARDS findet man z.B. bei intratrachealer Instillation von
Endotoxin (Tasaka et al. 1996) (Terashima et al. 1994), Komplement (Bathe et al. 2002),
TNF-α (Wagner et al. 2000) oder Bakterien (Zhang et al. 2002), also bei direkter
Alveolarschädigung, morphologisch ein Ödem, Fibrin, Collagen, Neutrophilenaggregate und
Erythrozyten in den Alveolen. Bei indirekter Schädigung – z.B. intravenöser (i.v.) oder intra-
peritonealer (i.p.) Injektion toxischer Substanzen - herrschen dagegen die mikrovaskuläre
Verstopfung, das interstitielle Ödem und eine geringere alveoläre Schädigung vor (Gattinoni
et al. 1998).
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Es ist also bei den direkten, d.h. inhalativen Noxen zuerst das Alveolarepithel, bei den
systemischen, d.h. indirekten zuerst das Endothel der Alveolarkapillaren betroffen. (Hoelz et
al. 2001).

1.1.2 Pathophysiologie
Obwohl seit der erstmaligen Beschreibung des ARDS in den 1960er Jahren (Ashbaugh et al.
1967) viele Forschungsergebnisse publiziert wurden, ist man von der endgültigen Aufklärung
des Pathomechanismus immer noch entfernt.
Gemäß dem derzeitigen Wissensstand ist das ARDS aus pathophysiologischer Sicht ein
zweiphasiger Prozess mit einer Akut- und einer Spätphase.
Die Akutphase, in der die höchste Mortalität auftritt, beginnt etwa 24h nach Einwirken der
Noxe, spätestens aber nach 72h (Connelly et al. 1997) (Pepe et al. 1982) und dauert ca. eine
Woche. In dieser Akutphase werden sowohl von den direkten als auch von den indirekten
Auslösern die verschiedenen klassischen Mediatorsysteme wie Kinin-, Gerinnungs-,
Histamin- und Komplementsystem sowie Arachidonsäurekaskade aktiviert. Es kommt zu
einer Erhöhung der Konzentration an inflammatorischen Zytokinen (IL-6, IL-8 und TNF-α)
im systemischen und pulmonalen Blutkreislauf. Die Entzündungsmediatoren C5a und
Leukotrien LTB4 sollen dafür verantwortlich sein, dass die Neutrophilen Granulozyten
in die Lunge gelockt und dort abgefangen werden.
Die aktivierten PMNs setzten ihrerseits Mediatoren wie TNF-α und Interleukine frei, die die
inflammatorische Antwort antreiben. Daneben sezernieren PMNs aber auch Sauerstoff-
radikale und Proteasen, die zu einer Kapillarschädigung führen können. Von den PMNs
freigesetzte Arachidonsäurederivate verändern die pulmonalvaskuläre Autoregulation. Die
Zytokine führen auch dazu, dass Endothelien, Makrophagen und Granulozyten über den
L-Arginin-Weg sauerstoffhaltige Radikale in Form von NO freisetzen, was eine
Vasodilatation sowohl im Pulmonalstromgebiet als auch auf systemischer Ebene zur Folge
hat.
Die Permeabilitätssteigerung führt zu einem interstitiellen Lungenödem und zu einer
exsudativen Alveolitis. Beide Faktoren zusammen vergrößern die Diffusionsstrecke für Gase.
Werden die Alveozyten angegriffen und sterben diese ab wird kein Surfactant mehr gebildet,
welcher das Kollabieren der Alveolen verhindert. Infolge dessen kommt es zu
Atelektasenbildung. Ist das alveoläre Epithel zerstört, sammelt sich Exsudat im Alveolarraum
an, was das Bild der sog. Hyalinen Membranen verursacht. Die Folgen für den Gasaustausch
sind offensichtlich, da hierfür folgender Zusammenhang gilt:
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