Paloma Navas Navarro

184 Pages·2016·7.67 MB·Spanish

UNIVERSIDAD DE VALLADOLID 

Facultad de Medicina 

Instituto de Biología y Genética Molecular (IBGM) 

Dpto. de Bioquímica y Biología Molecular y Fisiología 

2+
Diseño de un nuevo sensor de Ca  y su aplicación a 
los orgánulos intracelulares ex vivo e in vivo. 

Memoria de tesis para optar al grado de doctor presentada por 

Paloma Navas Navarro 

Directores:  
Dr. Javier García‐Sancho Martín 
Dra. María Teresa Alonso Alonso 

Valladolid, Julio de 2016

ABBREVIATIONS .....................................................................................1 
SUMMARY..............................................................................................5 
INTRODUCTION ....................................................................................11 
  1. Ca2+ as a second messenger..............................................................13 
  1.1. Ca2+ entry mechanisms to the cytosol........................................14 
1.1.2. Ca2+ channels of endomembranes.........................................16 
  1.2. Cytosolic Ca2+ extrusion mechanisms.........................................17 
1.2.1. Plasma membrane.................................................................17 
1.2.2. Endomembranes....................................................................18 
1.3. [Ca2+]  buffering systems..............................................................19 
C
1.3.1. Mitochondria..........................................................................19 
1.3.2. Ca2+ buffering proteins...........................................................19 
1.3.2.1 Calmodulin........................................................................19 
1.3.2.2 Other Ca2+ binding proteins..............................................22 
  1.4. [Ca2+]  homeostasis in tissues....................................................22 
ER
1.4.1. Monocytes.............................................................................23 
1.4.2. Langerhans islets....................................................................23 
1.4.3. Hippocampus.........................................................................24 
1.4.4. Hypophysis.............................................................................25 
1.4.5. Striated muscle ......................................................................25 
  2. Ca2+ sensors.......................................................................................26 
  2.1. Synthetic indicators....................................................................26 
  2.2. Genetically encoded Ca2+ indicators (GECIs)...............................30 
2.2.1. Bioluminescent GECIs.............................................................30 
2.2.1.1. Aequorin..........................................................................30
2.2.1.2. BRET based Ca2+ sensors..................................................33 
2.2.2. Fluorescent GECIs..................................................................34 
2.2.2.1. The Green Fluorescent Protein........................................34 
2.2.2.2. Red fluorescent proteins.................................................38 
2.2.2.3. FRET based Ca2+ sensors..................................................40 
2.2.2.3.1. Chameleons ..............................................................40 
2.2.2.3.2. Troponin based Ca2+ sensors.....................................42 
2.2.2.4. Non‐FRET based Ca2+ sensors..........................................43 
2.2.2.4.1. Camgaroo..................................................................43 
2.2.2.4.2. Pericam.....................................................................44 
2.2.2.4.3. GCaMPs.....................................................................45 
2.2.2.4.4. GECOs........................................................................46 
2.2.2.5 Low affinity Ca2+ sensors..................................................47 
  3. In vivo measurements through GECIs expression.............................50 
  4. Background: GAP and GAP1.............................................................52 
OBJECTIVES...........................................................................................57 
MATERIALS AND METHODS ..................................................................61 
  1. List of plasmids.................................................................................63 
  2. Generation of GAP mutants..............................................................63 
  3. Protein induction and extraction......................................................64 
  4. Protein purification...........................................................................67 
  5. Coomassie staining...........................................................................67 
  6. Fluorescence spectra........................................................................67 
  7. Fluorescence measurements in the plate reader.............................68 
  7.1. Analysis and characterization of GAP mutants...........................68
7.2. GAP in vitro titration...................................................................68 
  7.3. Effect of pH.................................................................................69 
  7.4. Effect of divalent metals.............................................................69 
  8. Expression in mammal cells..............................................................70 
  9. Western blot.....................................................................................71 
  10. Generation of transgenic mice........................................................72 
  11. Histology.........................................................................................74 
  12. Inmunofluorescence.......................................................................74 
  13. Mice spleen inmune cells extraction...............................................76 
  14. Flow cytometry...............................................................................77 
  15. Hippocampus cultures....................................................................77 
  16. Langerhans islets isolation..............................................................78 
  17. Hypophysis extraction.....................................................................79 
  18. Hippocampus slices.........................................................................79 
  19. Ca2+ cell imaging measurements.....................................................79 
  20. Generation of transgenic flies.........................................................83 
  21. In vivo [Ca2+]  measurement in Drosophila striated muscle...........84 
ER
  22. Statistical analysis...........................................................................86 
  23. List of materials...............................................................................86 
RESULTS................................................................................................87 
  1. GAP mutants design and analysis......................................................89 
  2. In vitro GAP2 characterization..........................................................93 
  2.1. GAP2 purification........................................................................93 
  2.2. Fluorescence spectra..................................................................94 
  2.3. In vitro GAP2 titration.................................................................95
2.4. GAP2 pH sensitivity....................................................................97 
  2.5. Other divalent cations effects....................................................98 
  3. GAP2 expression in mammal cells..................................................100 
  3.1. In situ erGAP2 titration................................................................102 
  3.2. [Ca2+]  measurement in intact cells.........................................103 
ER
  4. GAP2 modifications to increase brightness....................................108 
  5. GAP3 characterization....................................................................113 
  5.1. Fluorescence spectrum............................................................114 
  5.2. In vitro and in situ titration.......................................................115 
  5.3. erGAP1, erGAP2 and erGAP3 comparison................................116 
  6. GAP3 expression in Golgi Apparatus ..............................................118 
7. Transgenic animals models ..............................................................120 
  7.1. Transgenic mice........................................................................120 
  7.2. Transgenic flies.........................................................................123 
  8. Concept tests of erGAP3 behaviour in different biologic systems..123 
  8.1. In vitro [Ca2+]  measurements in mice monocytes..................123 
RE
  8.2. In vitro [Ca2+]  measurements in hippocampal glia and neurons 
RE
in primary cultures............................................................................126 
  8.3. Ex vivo [Ca2+]  measurements in Langerhans islets.................128 
RE
  8.4. Ex vivo [Ca2+]  measurements in adenohypophysis................131 
RE
  8.5. Ex vivo functional distribution of acetilcholine metabotropic 
receptors in hippocampus slices.......................................................134 
  8.6. In vivo [Ca2+]  measurements in striated muscle sarcoplasmic 
RE
reticulum of transgenic flies..............................................................137 
DISCUSSION........................................................................................141 
  1. Development of a new Ca2+ sensor ................................................143
2. New Ca2+ sensor characterization...................................................146 
  3. Possible GAP mechanism of action.................................................151 
  4. Concept tests and in vivo measurements.......................................153 
CONCLUSIONS ....................................................................................159 
BIBLIOGRAPHY....................................................................................163

ABREVIATURAS 

No hay talento más valioso que el de no usar dos palabras 
cuando basta una. 
Thomas Jefferson 

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