Microscopie par génération de troisième harmonique appliquée à la biologie.

245 Pages·2017·47.6 MB·French

by  Delphine Débarre

Institutnational de la
santé et de la recherchemédicale ÉCOLE
POLYTECHNIQUE
´
Th`ese de doctorat de l’Ecole Polytechnique
Spe´cialite´ : BIOPHYSIQUE
Microscopie par ge´ne´ration de troisie`me
harmonique applique´e a` la biologie
pr´esent´ee par
´
Delphine DEBARRE
pour obtenir le titre de Docteur de l’E´cole Polytechnique
soutenue le 15 septembre 2006 devant la Commission d’Examen compos´ee de
Pr. Yaron SILBERBERG Pr´esident
Pr. Claude BOCCARA Rapporteur
Pr. J´erˆome MERTZ Rapporteur
Dr. Emmanuel BEAUREPAIRE Directeur de th`ese
Pr. Jean-Louis MARTIN
Pr. Jean-Paul THIERY
Th`ese effectu´ee au
Laboratoire d’Optique et Biosciences
´
CNRS UMR 7645 - INSERM U696 -Ecole Polytechnique - ENSTA

Merci !
A tous ceux qui m’ont aid´ee dans mon travail...
JEAN-LOUIS
MARTIN
LE JURY
MARIE-CLAIRE, MANUEL,
FRANÇOIS, ANTIGONI ET
ANTONELLO
LA DGA
(SOUTIEN
MATERIEL)
UN MERCI
PARTICULIER A
EMMANUEL…
LAURE, CHRISTELLE,
MES COPAINS DE LABO:
XAVIER ET JEAN-MARC (QUI FONT
WILLY, CATHIE, CLÉMENT, ERIC,
TOURNER LE LABO)
THIERRY, ANNE, THIBAULT…
MES PAUVRES VOISINS
DE BUREAU : ANA,
EDWARD ET NICOLAS ET BIEN SUR
L’ENSEMBLE
DU LOB !
...ou qui m’ont support´ee en dehors (et vice versa)...
Fabien
Mes parents, Seg,
Etienne, Antoine,
Jeannine…
Pascal
Simona
Marie
Sara
Lolo
et surtout
Laurent
Henri
Guillaume
vanessa
Seb F Jennifer
Kevin
Adeline et Rémy
Seb C
...et pour finir `a tous ceux que je n’ai pas cit´es et qui ne m’en voudront
pas (n’est-ce pas?)

Table des mati`eres
Pr´eambule 1
1 Introduction 5
1.1 Principe de la g´en´eration de troisi`eme harmonique . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
1.2 La microscopie optique non lin´eaire . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
1.2.1 Principe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
1.2.2 Avantages et inconv´enients . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
1.2.3 Comparaison avec d’autres techniques d’imagerie . . . . . . . . . . . . . . 14
1.2.4 Quelques exemples d’utilisation en biologie . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
1.3 Caract´eristiques de la microscopie THG . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
1.3.1 Sectionnement optique intrins`eque . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
1.3.2 Modes de contraste . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
1.3.3 Invasivit´e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
1.3.4 P´en´etration dans les tissus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
1.3.5 Combinaison avec d’autres techniques de microscopie . . . . . . . . . . . . 24
1.4 Etat de l’art de la microscopie THG . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
1.4.1 D´emonstrations de principe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
1.4.2 Applications en imagerie structurale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
1.4.3 Etudes des sources de signal endog`enes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
1.4.4 D´eveloppements techniques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
1.5 Dispositif exp´erimental pour l’imagerie THG . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
1.5.1 Les sources utilis´ees . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
1.5.2 Mise en forme du faisceau . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
1.5.3 Description du microscope . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
2 Facteurs g´eom´etriques en imagerie THG 35
2.1 Influence de la g´eom´etrie de l’´echantillon sur le niveau de signal . . . . . . . . . . 35
2.1.1 Une ou plusieurs interfaces planes perpendiculaires `a la propagation . . . . 36
2.1.2 Une ou plusieurs interfaces planes parall`eles `a la propagation . . . . . . . . 49
2.1.3 Sph`ere uniforme centr´ee sur le faisceau . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56
2.1.4 R´ecapitulatif . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60
2.2 Focalisation et s´election des structures visibles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60
2.2.1 S´election en taille de certaines structures . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62
2.2.2 Comparaison de g´eom´etries diff´erentes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65
Table des mati`eres
2.2.3 Applications . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69
2.3 Caract`ere directionnel de l’´emission et efficacit´e de d´etection . . . . . . . . . . . . 72
2.3.1 Analyse th´eorique dans le cas d’un objet isol´e . . . . . . . . . . . . . . . . 72
2.3.2 Effet de la diffusion et de l’absorption du milieu . . . . . . . . . . . . . . . 79
2.3.3 R´ecapitulatif . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84
2.4 Conclusion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86
3 Sources de signal en microscopie THG 87
3.1 Mesure de la susceptibilit´e non lin´eaire d’une solution . . . . . . . . . . . . . . . . 87
3.1.1 Principe de la mesure . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 88
3.1.2 Mesure de la susceptibilit´e d’ions en solution . . . . . . . . . . . . . . . . . 103
3.1.3 Transposition en microscopie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 108
3.2 Identification des structures biologiques donnant un fort signal THG . . . . . . . . 113
3.2.1 Les corps lipidiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 113
3.2.2 Autres structures visibles en microscopie THG . . . . . . . . . . . . . . . . 121
3.2.3 Conclusion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 126
3.3 Applications en biologie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 126
3.3.1 Contexte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 126
3.3.2 Quantification des corps lipidiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 127
´
3.3.3 Etude de la dynamique des corps lipidiques in vivo . . . . . . . . . . . . . 130
3.3.4 Imagerie multimodale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 131
3.4 Conclusion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 136
4 Imagerie THG de l’embryon de drosophile 137
4.1 Contexte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 137
4.1.1 La drosophile : un organisme mod`ele . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 138
4.1.2 Visualiser et quantifier les mouvements morphog´en´etiques : enjeu . . . . . 144
4.1.3 Les m´ethodes d’imagerie du d´eveloppement de la drosophile . . . . . . . . 146
4.2 Imagerie THG du d´eveloppement des embryons de Drosophile . . . . . . . . . . . 150
4.2.1 L’embryon de drosophile en microscopie THG . . . . . . . . . . . . . . . . 150
4.2.2 Quantification des mouvements morphog´en´etiques : la PIV . . . . . . . . . 151
4.2.3 Comparaison avec les autres techniques d’imagerie . . . . . . . . . . . . . . 155
4.3 Imagerie et perturbation du d´eveloppement . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 157
4.3.1 Interactions laser-tissus et perturbations biologiques . . . . . . . . . . . . . 158
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4.3.2 Evaluation de la toxicit´e de l’imagerie THG . . . . . . . . . . . . . . . . . 162
4.3.3 Discussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 169
4.3.4 Conclusion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 173
4.4 Applications `a l’´etude de la perturbation des mouvements . . . . . . . . . . . . . 174
4.4.1 Etude de mouvements morphog´en´etiques apr`es photoablation . . . . . . . 174
4.4.2 D´emonstration dans des organismes mutants . . . . . . . . . . . . . . . . . 176
4.5 Perspectives . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 179
Conclusion 180
Table des mati`eres
A D´efinition des susceptibilit´es non lin´eaires 185
B Formulation g´en´erale du champ THG diffus´e 187
B.1 Expression exacte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 187
B.2 Approximations . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 189
B.2.1 Direction de la polarisation induite . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 189
B.2.2 Forme du faisceau excitateur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 190
B.2.3 Approximation paraxiale pour l’onde diffus´ee . . . . . . . . . . . . . . . . . 190
C Calcul de l’intensit´e THG cr´e´ee par une interface 193
C.1 Propagation de l’onde excitatrice dans l’´echantillon . . . . . . . . . . . . . . . . . 194
C.2 G´en´eration de troisi`eme harmonique par un milieu semi-infini . . . . . . . . . . . 195
C.3 Signal total de troisi`eme harmonique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 201
C.4 Cas d’une impulsion courte polychromatique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 205
C.5 Exploitation des exp´eriences de mesure de la susceptibilit´e . . . . . . . . . . . . . 206
D Indices lin´eaires des diff´erents verres et liquides 209
E Compl´ements de mat´eriels et m´ethodes 211